家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡的代謝組學(xué)分析及甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BmGT1的功能研究.pdf

1、家蠶(Bombyx mori)是完全變態(tài)的鱗翅目昆蟲，一生經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和蛾四個(gè)在形態(tài)結(jié)構(gòu)和機(jī)能上完全不同的發(fā)育階段。其中，幼蟲期是家蠶攝取食物進(jìn)行生長的階段，所汲取的營養(yǎng)物質(zhì)除了完成個(gè)體的生長外，還在幼蟲末期用來合成絲蛋白以形成蠶繭，同時(shí)為蛹體的構(gòu)建儲(chǔ)備營養(yǎng)物質(zhì);家蠶幼蟲生長到合適的大小，遂開始吐絲結(jié)繭，并在繭層內(nèi)完成幼蟲向蛹的轉(zhuǎn)變。蛹期是幼蟲過渡到成蟲的變態(tài)階段，為生殖系統(tǒng)的發(fā)育和成蟲器官的形成提供關(guān)鍵支持。毫無疑問，蠶蛹對(duì)于家蠶

2、的繁衍至關(guān)重要，而繭層則主要保護(hù)蠶蛹免遭自然環(huán)境危害、微生物感染和天敵獵食，同時(shí)可以用來生產(chǎn)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蠶絲。一個(gè)蠶繭的繭層和蠶蛹的重量通常是平衡的，如果繭層太少，不利于蠶蛹保護(hù);而蠶蛹太小，又不利于生殖。正因?yàn)槿绱司畹倪M(jìn)化，家蠶在地球上才能生存至今。
　　繭層和蠶蛹的平衡關(guān)系通常用繭層率來反映，該指標(biāo)是指繭層重占繭重的百分比。目前，生產(chǎn)上使用的家蠶，其繭層率分布范圍大概在10％到30％之間。盡管雜交選育可以使該性狀得到一

3、定程度的優(yōu)化，但是很難突破30％。究其原因有以下幾個(gè)方面:繭層率性狀受到遺傳調(diào)控，其遺傳穩(wěn)定性受環(huán)境影響較小，而受品種的影響相對(duì)較大;繭層重與蛹體重之間具有高度正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.85;家蠶吸收的干物質(zhì)用于形成繭層和構(gòu)建蛹體的比例約為1∶1。這些證據(jù)表明，家蠶在長期進(jìn)化過程中形成一種精密的調(diào)控機(jī)制，以確保家蠶用于合成繭層和構(gòu)建蛹體的營養(yǎng)物質(zhì)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡是其為了生存的生物學(xué)行為，是其長期進(jìn)化過程中有趣的生物學(xué)現(xiàn)

4、象，對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究可為生產(chǎn)上人為操控家蠶分配更多的營養(yǎng)物質(zhì)形成蠶絲提供切入點(diǎn)。鑒于此，本研究選擇了三組家蠶絲-蛹營養(yǎng)失衡的生物材料，即突變體裸蛹、摘除絲腺和敲除絲蛋白基因的家蠶，結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)比較分析所選材料的代謝物差異以及代謝通路中關(guān)鍵酶的變化，篩選影響絲-蛹營養(yǎng)平衡的代謝通路和關(guān)鍵調(diào)控基因，進(jìn)一步開展生物學(xué)功能驗(yàn)證。獲得的主要研究結(jié)果如下:
　　1.家蠶絲-蛹營養(yǎng)物質(zhì)失衡自然突變體血淋巴的代謝組學(xué)

5、>　　我們首先調(diào)查了7個(gè)家蠶品種的繭層率，它們之間的繭重相差較大，除裸蛹外，其余品種的繭層率均在10％到30％之間。而裸蛹因其后部絲腺嚴(yán)重退化，導(dǎo)致其合成的絲蛋白量顯著降低。因此，本研究選擇裸蛹(Nd)作為反證材料，同時(shí)選擇Dazao和21-872作為對(duì)照（為了描述方便將它們命為Nd組），探究家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡的調(diào)控機(jī)制。首先測定Nd組生化指標(biāo)，結(jié)果顯示五齡第3天，Nd血淋巴中海藻糖含量較高，脂肪體中糖原和ATP含量較高，三酰甘油含量較

6、低。
　　本研究建立了一套家蠶血淋巴的“全組分”非靶向代謝組學(xué)分析方法。運(yùn)用該方法對(duì)Nd組血淋巴進(jìn)行檢測，最終獲得100個(gè)結(jié)構(gòu)被鑒定的化合物，并對(duì)其中的82個(gè)化合物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證。對(duì)五齡第3天到第6天Nd組血淋巴代謝特征的主成分分析發(fā)現(xiàn)，Nd與Dazao或21-872具有明顯的分離趨勢，兩個(gè)對(duì)照之間沒有分離趨勢。這一結(jié)果說明，Nd血淋巴中有與對(duì)照存在差異的代謝物。將五齡第6天的Nd與Dazao進(jìn)行比較，獲得46個(gè)化合物結(jié)構(gòu)被鑒定

7、的差異代謝物。其中有15個(gè)代謝物在Nd血淋巴中含量高于Dazao，主要包括尿酸、甘氨酸、氨基丙二酸、絲氨酸、脯氨酸、羊毛硫氨酸、乙醇酸和谷氨酸等，特別是尿酸和甘氨酸在Nd中的富集尤為明顯。Nd血淋巴中含量低于Dazao的代謝物有31個(gè)，主要包括糖類（肌醇、來蘇糖、2-酮基-葡糖酸）、三羧酸TCA循環(huán)（檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸，）的中間代謝物、脂類及脂代謝途徑（甘油酸、膽固醇、十八酸、甘油、亞麻酸）和氨基酸等（甲硫氨酸、鳥氨酸、異亮氨酸、

8、羥脯氨酸）。
　　2.人為阻礙絲蛋白合成導(dǎo)致家蠶絲-蛹營養(yǎng)失衡的代謝組學(xué)研究
　　敲除家蠶絲素重鏈基因Bmfib-H（Bmfib-H gene knock-out，F(xiàn)GKO）、摘除家蠶絲腺(Silk glands extirpation，SGE)都能夠阻礙絲蛋白的合成，導(dǎo)致絲產(chǎn)量急劇降低、蛹體重顯著增加。為了描述方便將Bmfib-H基因敲除品系和其對(duì)照統(tǒng)稱為FGKO組，摘除絲腺、假手術(shù)和正常統(tǒng)稱為SGE組。首先進(jìn)行了生物學(xué)統(tǒng)

9、計(jì)，結(jié)果表明FGKO的蛹重增加了19.08％，繭層率降低了67.2％。SGE的蛹重增加了32.49％。之后的PLS-DA分析表明，F(xiàn)GKO組或SGE組血淋巴代謝特征發(fā)現(xiàn)處理組與其對(duì)照的分離趨勢都非常明顯，這說明敲除Bmfib-H基因或摘除絲腺后血淋巴的代謝特征發(fā)生了顯著變化。在此基礎(chǔ)上，開展了差異代謝物的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGKO組中有60個(gè)結(jié)構(gòu)被鑒定的差異代謝物，其中僅有5個(gè)代謝物在敲除Bmfib-H基因后含量升高。SGE組摘除絲腺和假手

10、術(shù)之間存在66個(gè)結(jié)構(gòu)被鑒定的差異代謝物，其中只有9個(gè)差異物代謝物在摘除絲腺后含量升高。FGKO組和SGE組的大多數(shù)差異代謝物與Nd組的差異代謝物變化趨勢類似，即甘氨酸、氨基丙二酸、絲氨酸、尿酸和脯氨酸等含量增加，鳥氨酸、提供能量的物質(zhì)（自由脂肪酸、糖類物質(zhì)、TCA循環(huán)中間代謝物）含量降低。
　　進(jìn)一步綜合分析表明，同時(shí)在三組生物材料中都能檢測到的差異代謝物有16個(gè)，至少能在其中兩組中檢測到的差異代謝物有51個(gè)。對(duì)這些共同鑒定到的差

11、異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，結(jié)果顯示較多差異代謝物集中在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑，氮代謝途徑和氨酰-tRNA生物合成途徑等。FGKO組差異代謝物相關(guān)性分析顯示差異代謝物聚類為兩個(gè)簇，并以甘氨酸、氨基丙二酸作為橋梁連接它們，且甘氨酸與繭層率的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值高達(dá)0.892。以上結(jié)果說明甘氨酸在家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡中扮演重要角色。
　　3.家蠶FGKO組脂肪體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　分別在Dazao和Bmfib-H基因敲除后脂

12、肪體中鑒定到1767和1705個(gè)蛋白質(zhì)。應(yīng)用BLAST2GO程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)功能進(jìn)行注釋，并根據(jù)功能注釋將其分為20類，主要包括酶類、30K蛋白、轉(zhuǎn)錄與翻譯相關(guān)蛋白、熱激蛋白、SP蛋白、能量相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞骨架、蛋白酶及蛋白酶抑制劑等。酶類在脂肪體中的豐度最高，Bmfib-H基因敲除后酶類豐度有所下降。轉(zhuǎn)錄和翻譯類蛋白在脂肪體中的豐度也較高，Bmfib-H基因敲除后轉(zhuǎn)錄翻譯類蛋白質(zhì)的豐度顯著增加。推測敲除Bmfib-H基因后脂肪體將合

13、成更多的蛋白質(zhì)，然后儲(chǔ)存于蛹體或者為蛹期蛋白質(zhì)的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。另外，能量相關(guān)蛋白、免疫相關(guān)蛋白的豐度在Bmfib-H基因敲除后明顯提高，性別特異貯藏蛋白(SP protein)、轉(zhuǎn)移蛋白酶和蛋白酶抑制劑在敲除Bmfib-H基因后的豐度顯著降低。
　　利用非標(biāo)定量LFQ方法篩選獲得662個(gè)差異蛋白質(zhì)。酶類有155個(gè)，其中含量降低的酶有113個(gè)。轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白有86個(gè)，其中75個(gè)蛋白質(zhì)含量升高，這說明敲除Bmfib-H基因后，脂

14、肪體中蛋白質(zhì)的合成更加旺盛。對(duì)差異蛋白質(zhì)參與的代謝途徑分析結(jié)果顯示，參與糖酵解、磷酸戊糖途徑和甘氨酸-絲氨酸合成途徑中的大多數(shù)酶的含量都有所降低;參與氧化磷酸化途徑中大多數(shù)酶的含量都有所增加。FGKO組脂肪體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明脂肪體中糖代謝減弱;甘氨酸、絲氨酸的合成降低;蛋白質(zhì)的合成增加?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們測定了脂肪體中糖原和蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果顯示糖原和蛋白質(zhì)的含量都顯著增加。這說明FGKO阻礙絲蛋白的合成，這使更多的營養(yǎng)物質(zhì)以糖

15、原和蛋白質(zhì)的形式存儲(chǔ)于脂肪體中。
　　4.家蠶甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BmGT1的功能研究
　　代謝組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲-蛹營養(yǎng)失衡后，血淋巴中甘氨酸含量顯著增加。為了進(jìn)一步探究甘氨酸在絲-蛹營養(yǎng)平衡中所發(fā)揮的作用，我們通過體外注射方式向蠶體血淋巴中添加額外的甘氨酸或調(diào)控甘氨酸的ACPC。檢測能夠反映絲-蛹關(guān)系的繭層率，結(jié)果顯示注射甘氨酸或ACPC后分別增加了3.54％和3.89％。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，脂肪體中甘氨酸-絲氨酸

16、合成途徑中的關(guān)鍵酶含量有所降低。在此基礎(chǔ)上，我們利用qPCR技術(shù)檢測這些酶在絲-蛹營養(yǎng)失衡后的中腸、脂肪體和絲腺中的表達(dá)變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲氨酸合成途徑中的基因BmPSGDH、BmPSAT、BmPSPH在敲除Bmfib-H基因后中腸中表達(dá)量顯著降低;相反，甘氨酸合成途徑相關(guān)基因BmSHMT、 BmAGXT、 BmGMT、 BmOAT在中腸中表達(dá)量升高。同時(shí)，家蠶甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BmGT1在FGKO和SGE的中腸中表達(dá)量顯著降低。

17、>　　BmGT1基因是家蠶受人工選擇的候選基因之一，與人類生長疾病相關(guān)基因同源。該基因編碼的蛋白質(zhì)與多巴轉(zhuǎn)運(yùn)載體三維結(jié)構(gòu)高度同源，并且該基因在中腸中特異表達(dá)。因此，我們對(duì)該基因開展了生物學(xué)功能的驗(yàn)證。首先在細(xì)胞水平上添加甘氨酸或ACPC，結(jié)果使BmGT1基因的表達(dá)量顯著降低。與此同時(shí)，細(xì)胞水平干涉或過量表達(dá)該基因，結(jié)果影響了甘氨酸-絲氨酸合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)量。個(gè)體水平上注射該基因的抑制劑后，家蠶的繭層率顯著提高，增加了5.986％。

18、綜上所述，BmGT1基因與家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡調(diào)控密切相關(guān)。
　　本研究結(jié)合了代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，選取三組生物材料進(jìn)行研究，這三種材料在不同程度上阻礙了絲的合成，導(dǎo)致家蠶絲-蛹營養(yǎng)失衡。研究結(jié)果顯示，甘氨酸和甘氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶在代謝物水平、蛋白質(zhì)水平和核酸水平上都發(fā)生了顯著變化，并通過代謝物注射的方法，證明了甘氨酸在家蠶絲-蛹營養(yǎng)平衡中發(fā)揮著重要的作用。最后，應(yīng)用分子生物學(xué)研究策略，驗(yàn)證了甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BmGT1通過