家蠶表皮蛋白基因的表達(dá)譜分析及表皮蛋白BmorCPT1的功能研究.pdf

1、昆蟲表皮是生物界最堅(jiān)固的結(jié)構(gòu)之一，是昆蟲適應(yīng)復(fù)雜外界環(huán)境的重要保護(hù)器官。外骨骼的主要成分是表皮蛋白和幾丁質(zhì)組成，因此表皮蛋白是昆蟲重要的結(jié)構(gòu)蛋白。蛻皮激素和保幼激素的節(jié)律性變化調(diào)控昆蟲的生長發(fā)育和蛻皮變態(tài)，而在昆蟲蛻皮變態(tài)過程中表皮是變化最明顯的器官。作為表皮重要組分的表皮蛋白的編碼基因必然受到了激素的嚴(yán)格調(diào)控，因此表皮蛋白基因是研究昆蟲激素調(diào)控的理想靶標(biāo)。然而，激素對表皮蛋白基因的表達(dá)調(diào)控仍所知有限。而目前表皮蛋白基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的缺乏

2、是認(rèn)識這一科學(xué)問題的主要障礙。多個昆蟲基因組數(shù)據(jù)的解析表明，表皮蛋白基因構(gòu)成了一個龐大的基因家族。家蠶利用多于1％的基因組編碼了超過200個表皮蛋白基因，目前的研究主要集中昆蟲激素及調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子對它們的調(diào)控，包括調(diào)控表皮蛋白基因的轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及分析，而關(guān)于表皮蛋白的功能知之甚少。
　　 昆蟲依靠先天性免疫系統(tǒng)應(yīng)對外界微生物的侵染。主要依賴于體內(nèi)的模式識別蛋白區(qū)別“自己”和“非己”，同時(shí)這些識別蛋白也是激活昆蟲體內(nèi)免疫反應(yīng)的最

3、重要的分子。不同的識別蛋白能夠識別并結(jié)合不同種類的微生物。前人的研究已經(jīng)在昆蟲中鑒定到了多個模式識別蛋白和微生物結(jié)合蛋白，這些蛋白質(zhì)主要包括肽聚糖識別蛋白PGRP、葡聚糖識別蛋白GNBP/βGRP、LPS結(jié)合蛋白以及凝集素分子等等，除此之外尚未鑒定到能夠結(jié)合微生物并同時(shí)能夠激活昆蟲免疫反應(yīng)的其他蛋白質(zhì)。昆蟲的先天性免疫是一種全身性反應(yīng)，當(dāng)受到外界微生物侵染時(shí)，其體內(nèi)的體液免疫反應(yīng)迅速激活，啟動TOLL和IMD途經(jīng)和酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生抗

4、菌肽和激活血液黑化反應(yīng);同時(shí)昆蟲的血細(xì)胞通過吞噬、集結(jié)和形成包囊的形式參與微生物的殺滅和清除。果蠅中的研究表明革蘭氏陽性細(xì)菌引起的TOLL途經(jīng)的激活需要PGRP-SA、PGRP-SD與GNBP1等至少三種蛋白的共同參與，表明微生物的識別過程是由多種識別蛋白共同參與的復(fù)雜過程，這一模式在其他的昆蟲中可能同樣存在。
　　 家蠶的基因組在鱗翅目昆蟲中得到了最為詳盡的研究，其基因組和EST序列較為完善，并建立了全基因組基因芯片平臺，這為

5、家蠶表皮蛋白基因的鑒定及表達(dá)譜的分析提供了可能。與果蠅相比，家蠶的先天性免疫的研究較為落后，其原因在于相關(guān)的基礎(chǔ)研究較為薄弱，缺乏基因功能研究對應(yīng)的突變體。然而，家蠶的優(yōu)勢在于其體型較大，易于獲得更多的體液和參與免疫反應(yīng)的組織樣本。本研究利用生物信息學(xué)的方法鑒定了家蠶基因組編碼的表皮蛋白基因，并利用基因芯片的方法研究了家蠶表皮蛋白基因的時(shí)期表達(dá)譜;同時(shí)對家蠶的Tweedle表皮蛋白家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的研究。另外，采用熒光

6、素酶報(bào)告系統(tǒng)、Northernblot、Westernblot、染色質(zhì)免疫共沉、免疫熒光、免疫共沉淀、LC-MS/MS以及piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因等技術(shù)方法對BmorCPT1基因的表達(dá)調(diào)控和功能進(jìn)行了探討。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1.家蠶表皮蛋白基因的表達(dá)譜研究
　　 通過生物信息學(xué)的方法，在家蠶基因組中鑒定到255個表皮蛋白基因，其中包括151個CPR基因、5個CPF/CPFL基因、4個Tweedle基因

7、、51個CPG基因以及44個CPH基因。并對11種已經(jīng)完成基因組測序的昆蟲的表皮蛋白基因的數(shù)目進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)雙翅目昆蟲中表皮蛋白基因較其他昆蟲更多，鱗翅目昆蟲基因數(shù)目處于中間水平。
　　 利用家蠶全基因組芯片的23134個探針研究了家蠶表皮組織的表達(dá)譜，在11個發(fā)育時(shí)期內(nèi)共檢測6676個基因的表達(dá)。等級聚類的結(jié)果表明，11個時(shí)期明顯聚類為兩群，第一群的時(shí)間點(diǎn)主要處于家蠶食桑期，第二群則主要在家蠶蛻皮期。K-means聚類顯示表

8、皮組織表達(dá)的6676個基因具有3種不同的表達(dá)模式，分別含有2450，1853和2373個基因。GO分類的結(jié)果顯示，3種表達(dá)模式的基因在功能分類上具有明顯的差異。這些結(jié)果表明，家蠶在食桑期與沒有進(jìn)食的眠期，表皮組織基因的表達(dá)具有明顯不同。進(jìn)一步篩查了4齡眠期對比4齡4天、上蔟3天對比上蔟2天共同上調(diào)和下調(diào)表達(dá)大于或等于4倍的基因，共鑒定到94個上調(diào)表達(dá)和2個下調(diào)表達(dá)的基因。
　　 家蠶基因組中共鑒定得到255個表皮蛋白基因，其中2

9、49個基因具有對應(yīng)的寡聚核苷酸探針。其中，227(93％)個探針檢測到表達(dá)信號。3對表皮蛋白基因由于核苷酸序列高度相似，因此無法設(shè)計(jì)單個基因特異的探針;6個基因無法設(shè)計(jì)合適的探針，但是獲得了其EST數(shù)據(jù)。進(jìn)一步采用Northemblot檢驗(yàn)了基因芯片結(jié)果的可信度。通過聚類分析，選擇的16個發(fā)育時(shí)期聚類為兩群，其中第一群主要是生長期，第二群則主要包括幼蟲眠期和蛹期末期，且兩群的基因表達(dá)模式差異較大。表明家蠶表皮蛋白基因的表達(dá)受到自身發(fā)育狀

10、態(tài)的影響較大，暗示激素調(diào)控家蠶表皮蛋白基因。K-means聚類分析的結(jié)果表明，家蠶表皮蛋白基因能夠分為5類不同的表達(dá)模式，分別標(biāo)注為A-E組，其中A組的表皮蛋白基因在幾乎所有的16個發(fā)育時(shí)期均有高水平的表達(dá);B和C組的基因主要是在幼蟲蛻皮期、預(yù)蛹末期以及蛹末期具有較高水平的表達(dá);D組的基因代表了主要在蛹期高表達(dá)的表皮蛋白基因;E組的基因的表達(dá)模式則比較雜亂。另外，分析發(fā)現(xiàn)B組的基因在蛹期比C組具有更高水平的表達(dá)信號。分析表明表皮蛋白基因

11、的表達(dá)模式與保守的氨基酸基序之間沒有必然的聯(lián)系。B、C組包括101個表皮蛋白基因中，有49個分布于22號染色體上，而這些基因均屬于CPR基因家族。表明家蠶的表皮蛋白基因在染色體上的分布并不是隨機(jī)分布的，而是具有相對集中的分布特點(diǎn)。進(jìn)一步分析22號染色體上的49個基因，發(fā)現(xiàn)其中26在幼蟲期至預(yù)蛹期具有一致的表達(dá)模式，并在其基因的啟動子區(qū)域鑒定到了3個共有的保守元件，推測其可能具有協(xié)同表達(dá)的模式。
　　 2.家蠶中含有Tweedle

12、基序的表皮蛋白基因生物信息學(xué)分析及表達(dá)譜研究
　　 通過11種昆蟲的比較，發(fā)現(xiàn)Tweedle基因的數(shù)目在不同昆蟲中差異較大，最多的黑腹果蠅具有27個，最少的蚜蟲只有3個，4種鱗翅目昆蟲中均只含有4個Tweedle基因。家蠶的4個Tweedle基因分別命名為BmorCPT1-4。通過對11種昆蟲的81條Tweedle基因的氨基酸序列分析表明，不同昆蟲的Tweedle基因的氨基酸序列分化較大，然而在Tweedle基序的某些位點(diǎn)上是保

13、守的，將Tweedle基序的4個BLOCK概括為:KxxY/F、YK/RxxxFKAP、KTxxYVL、KPEVY/FFxKY，其中x為V、I、L等疏水性的氨基酸。系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果表明鱗翅目昆蟲的Tweedle基序更為保守;來自黑腹果蠅的14個Tweedle基因與其他的基因分離而單獨(dú)聚為一支，支持了基因加倍的觀點(diǎn)。
　　 6種鱗翅目昆蟲的25個Tweedle基因的氨基酸序列分析和系統(tǒng)發(fā)生分析表明，BmorCPT1的同源基因與其

14、他具有較大的分化。BmorCPT1直向同源基因的結(jié)構(gòu)分析表明它們在核苷酸水平上差異較大;通過氨基酸序列的分析，在BmorCPT1蛋白質(zhì)羧基端鑒定到一個新的保守基序，包括18個氨基酸殘基。隨后的分析表明這一基序只存在于鱗翅目昆蟲的BmorCPT1同源蛋白質(zhì)的羧基端，遂將其命名為LSM(LepidopteraSpecificMotif)。
　　 利用RT-PCR的方法研究了家蠶Tweedle基因組織和時(shí)期表達(dá)譜。BmorCPT1基因

15、主要在表皮、精巢和頭部高量表達(dá)，在氣管和脂肪體有微弱的表達(dá)信號。BmorCPT2基因只在精巢和頭部檢測到微弱的表達(dá)信號。BmorCPT3基因在10個組織中均不表達(dá)。BmorCPT4基因在氣管、精巢、馬氏管、中腸微量表達(dá)。在胚胎期，BmorCPT1基因在96小時(shí)表達(dá)水平較高;BmorCPT2和BmorCPT3基因在產(chǎn)卵后96和120小時(shí)表達(dá);BmorCPT4基因在產(chǎn)卵后120小時(shí)有高量的表達(dá)。在家蠶胚胎后期，BmorCPT1基因的與其他的

16、3個Tweedle基因的表達(dá)譜具有明顯的差異，由RT-PCR的結(jié)果可以看出，除了3齡眠期、4齡眠期、蛹期4天至蛹6天微量表達(dá)，BmorCPT1基因在家蠶的絕大部分發(fā)育時(shí)期均有較高水平的表達(dá)。此外，BmorCPT1基因的表達(dá)還具有一個特點(diǎn)，在幼蟲期的前期均有較高水平的表達(dá)，而在該齡期末則表達(dá)水平較低，這一趨勢在3齡至5齡期的幼蟲表現(xiàn)尤為明顯。與BmorCPT1基因的表達(dá)模式不同，BmorCPT2～4基因的表達(dá)高峰則幾乎都出現(xiàn)在幼蟲期每個齡

17、期的眠期、預(yù)蛹期末以及蛹期的中后期，而其他時(shí)期表達(dá)水平極低或者沒有信號。BmorCPT1與其它的Tweedle基因時(shí)空表達(dá)譜差異較大，暗示它們可能分別承擔(dān)了不同的功能。
　　 3.BmorCPT1的表達(dá)調(diào)控與功能研究
　　 克隆了BmorCPT1基因上游2002bp(-1992bp至+10區(qū)域，翻譯起始位點(diǎn)為+1)區(qū)域，并在其-1442bp的位置鑒定到一個NF-κB因子的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建了基于pGL3-basic質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染

18、載體，通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Westernblot（使用熒光素酶抗體）證明BmorCPT1的啟動子能夠被LPS（脂多糖）激活，這種效應(yīng)能夠被NF-κB信號的專一性抑制劑PDTC抑制，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明NF-KB因子能夠結(jié)合在BmorCPT1基因的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)上，證明LPS對BmorCPT1基因的激活是由NF-κB信號介導(dǎo)的。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Westernblot保幼激素類似物JHA（苯氧威）激活BmorCPT1的啟動子，而

19、蛻皮激素類似物EA（蟲酰肼）對其沒有作用。進(jìn)一步分析表明，LPS的激活作用能夠被JHA和EA抑制;通過檢測NF-κB信號途經(jīng)上游的激酶IKKα/β的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)JHA不影響IKKα/β的磷酸化，而加入EA則導(dǎo)致IKKα/β磷酸化水平降低，表明兩種昆蟲激素對其抑制作用的位置是不同的。所有熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的結(jié)果經(jīng)過T-檢驗(yàn)分析具有顯著性差異。
　　 將去除信號肽的BmorCPT1基因的克隆到pET-28(a)載體上，將構(gòu)建的重組

20、質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21表達(dá)菌株，通過IPTG誘導(dǎo)了BmorCPT1重組蛋白的表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白存在于包涵體中，利用8M尿素溶解包涵體，通過組氨酸親和柱純化和超濾濃縮，并經(jīng)過銀染檢測，獲得的純化蛋白與目的蛋白分子量一致，表明重組蛋白己被純化，可用于免疫新西蘭公兔，制備抗體。通過檢測獲得抗體的效價(jià)達(dá)到1:32000。
　　 利用Westernblot分析了BmorCPT1蛋白在家蠶5齡3天組織中的表達(dá)，其中在表皮和頭部高量表達(dá)，在氣管中

21、和脂肪體低量表達(dá)。進(jìn)一步檢測了BmorCPT1蛋白在不同發(fā)育時(shí)期表皮組織中的分布，發(fā)現(xiàn)在家蠶4齡2天和3天表達(dá)量較高，進(jìn)入4齡眠期過程中，表達(dá)水平明顯下降;而在家蠶進(jìn)入5齡后，BmorCPT1蛋白的水平劇烈上升，并在5齡2天至5齡6天，逐漸下降。另外，在上蔟2天和3天的預(yù)蛹期表達(dá)水平較高，在進(jìn)入蛹期的過程中呈現(xiàn)出一種先下降而后迅速上升的趨勢，并保持較高的水平持續(xù)到蛹期第6天;在蛹期7天和8天以及成蟲表皮中沒有檢測到BmorCPT1蛋白質(zhì)

22、。在5齡期表皮中的BmorCPT1蛋白質(zhì)的表達(dá)量隨著其體重和體積不斷增大的同時(shí)反而不斷下降，表明BmorCPT1的表達(dá)量與家蠶的體形變化呈負(fù)相關(guān)。
　　 微生物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，BmorCPT1蛋白僅在微生物誘導(dǎo)后的家蠶血漿中被檢測到。在注射球孢白僵菌和黑胸?cái)⊙募倚Q血漿中3、6和12小時(shí)有較低水平的表達(dá);而在注射大腸桿菌6～24小時(shí)，則具有明顯的上升的趨勢，在注射24小時(shí)之后，信號達(dá)到峰值，這一趨勢與某些已知的免疫相關(guān)的蛋

23、白相類似，表明BmorCPT1基因?qū)τ诖竽c桿菌的侵染較球孢白僵菌和黑胸?cái)⊙用舾?。Northernblot分析顯示，大腸桿菌免疫后表皮組織中BmorCPT1基因表達(dá)沒有明顯差異，脂肪體中具有輕微的上調(diào)，血細(xì)胞中BmorCPT1在誘導(dǎo)后開啟表達(dá)。Westernblot分析表明，誘導(dǎo)前后表皮中BmorCPT1蛋白質(zhì)水平?jīng)]有明顯差異，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血漿中BmorCPT1蛋白質(zhì)條帶較表皮組織滯后，推測血漿中的BmorCPT1蛋白質(zhì)經(jīng)歷了翻譯后修飾

24、。脂肪體中BmorCPT1在誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，只在注射大腸桿菌的家蠶血細(xì)胞中檢測到BmorCPT1，而且在血細(xì)胞中檢測到與血漿中一致的滯后條帶，證明家蠶BmorCPT1的翻譯后修飾是在血細(xì)胞中發(fā)生的。基于文獻(xiàn)，猜測家蠶血漿中檢測到的BmorCPT1可能經(jīng)歷了糖基化修飾，對其進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示BmorCPT1氨基酸序列中不存在N-糖基化位點(diǎn);預(yù)測得到18個O-糖基化的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)集中出現(xiàn)在418～456位的氨基酸殘基，得分最高的是434

25、位的蘇氨酸。
　　 收集大腸桿菌免疫后的家蠶血漿進(jìn)行了細(xì)菌結(jié)合-免疫熒光實(shí)驗(yàn)，表明免疫后血漿中的BmorCPT1能夠強(qiáng)烈地結(jié)合大腸桿菌;Westemblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這一結(jié)果。為了進(jìn)一步分析BmorCPT1的功能，基于大腸桿菌免疫后的家蠶血漿，利用免疫共沉淀尋找BmorCPT1的結(jié)合蛋白，通過LC-MS/MS共鑒定到429個肽段匹配61個蛋白質(zhì)，其中包括肽聚糖識別蛋白PGRP-S5和脂多糖結(jié)合蛋白LBP。通過免疫共沉淀結(jié)合

26、Westernblot的方法證明翻譯后修飾的BmorCPT1能夠結(jié)合BmPGRP-S5和BmLBP。
　　 4.BmorCPT1的轉(zhuǎn)基因研究
　　 構(gòu)建了基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體，piggyBac{3xP3-DsRed-pDmHSP70-BmorCPT1_ORF-SV40}，簡寫為PBHT。利用黑腹果蠅HSP70基因的啟動子pDmHSP70驅(qū)動家蠶BmorCPT1基因的表達(dá)，以3xP3啟動子驅(qū)動的紅色熒光蛋

27、白DsRed作為轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記。最終共獲得了32頭G1代陽性個體，轉(zhuǎn)基因陽性率為28％。通過提取轉(zhuǎn)基因品系家蠶PBHT的基因組，利用反向PCR的方法確定轉(zhuǎn)基因載體插入到家蠶第12號染色體上，在基因組上的位置為chr12∶6278159-6278000。
　　 選擇BmorCPT1基因mRNA水平極低的4齡眠期的家蠶作為熱激處理的對象，經(jīng)過42℃，90分鐘的熱激處理，在熱激后4小時(shí)和8小時(shí)，利用Northernblot在經(jīng)過熱激處

28、理的轉(zhuǎn)基因家蠶(PBHT-AHS)中檢測到BmorCPT1基因的高量表達(dá)，對照組（未熱激轉(zhuǎn)基因家蠶PBHT-CON、熱激非轉(zhuǎn)基因家蠶WT-AHS和未熱激非轉(zhuǎn)基因家蠶WT-CON）中沒有檢測到BmorCPT1基因的mRNA。證明熱激處理能夠特異的激活pDmHSP70驅(qū)動BmorCPT1基因的表達(dá)。通過分析熱激處理對家蠶產(chǎn)卵-孵化率的影響，發(fā)現(xiàn)4組PBHT-AHS、PBHT-CON、WT-AHS和WT-CON家蠶的發(fā)育及產(chǎn)卵-孵化率沒有明顯

29、的差異，表明本次熱激實(shí)驗(yàn)對于家蠶的生長發(fā)育及生理狀態(tài)沒有影響。
　　 通過Northernblot分析發(fā)現(xiàn)家蠶肽聚糖識別蛋白BmPGRP-S5和脂多糖結(jié)合蛋白BmLBP基因在熱激處理后8小時(shí)的PBHT-AHS家蠶中上調(diào)表達(dá)，在三組對照組中保持本底水平表達(dá):另外，PBHT-AHS家蠶的抗菌肽基因BmGlv1和BmGlv4在熱激處理后8小時(shí)高量表達(dá)，對照組中檢測不到BmGlv1和BmGlv4基因的mRNA。表明在沒有任何微生物侵染的

30、情況下，提高BmorCPT1基因的表達(dá)水平能夠激活家蠶免疫相關(guān)基因的表達(dá)。BmorCPT1基因的異位表達(dá)能夠激活BmPGRP-S5和BmLBP基因、IMD途經(jīng)基因BmImd、BmDredd和BmRelish以及抗菌肽基因BmGlv1和BmGlv4在脂肪體中的表達(dá)。
　　 綜合上文細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們提出家蠶血細(xì)胞表達(dá)并完成翻譯后修飾的BmorCPT1分泌進(jìn)入血漿，能夠與肽聚糖識別蛋白BmPGRP-S5和脂多糖