NF-κB介導(dǎo)LPS對家蠶表皮蛋白基因BmCPT1的激活.pdf

1、昆蟲表皮是隔離其自身內(nèi)環(huán)境和外界復(fù)雜環(huán)境的一道重要屏障，也是其防御病原微生物的一道物理屏障，其主要成分是表皮蛋白和幾丁質(zhì)，因此表皮蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白。昆蟲的先天性免疫反應(yīng)通過其模式識(shí)別受體特異性識(shí)別病原菌表面的某些靶標(biāo)分子，區(qū)分出“自我”與“非我”成分，從而引發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫中的Toll信號(hào)途徑和IMD信號(hào)通路及酚氧化酶原級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌肽快速高效清除侵入的病原菌。NF-κB途徑是Toll和IMD信號(hào)通路下游的調(diào)控路徑

2、。受逐級(jí)呈遞的免疫信號(hào)活化，NF-κB家族的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子從抑制子上解離轉(zhuǎn)運(yùn)入核，結(jié)合到相關(guān)抗菌肽基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上，從而調(diào)控抗菌肽基因的表達(dá)。雖然家蠶（Bombyxmori）基因組框架序列在2004年已被測定，極大地推動(dòng)了家蠶先天性免疫方面的研究，但是家蠶表皮蛋白受到免疫信號(hào)激活方面的研究仍然很少。
　　 本文通過在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中檢索得到家蠶表皮蛋白基因BmCPT1的序列，對其上游2002bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分子克隆，并

3、利用TESS程序分析了該區(qū)域所含有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)BmCPT1基因的啟動(dòng)子內(nèi)含有一個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)。將該段序列連接到pGL3-basic載體上，將所獲得pGL3-basic{pBmorCPT1-Luciferase}報(bào)告載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到家蠶卵巢細(xì)胞BmN中，通過添加LPS和NF-κB信號(hào)阻斷劑PDTC檢測NF-κB能否激活BmCPT1基因的表達(dá)，并將檢測到的熒光素酶表達(dá)活性數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果證明BmCPT1基因的啟動(dòng)子能

4、被LPS激活，而這種激活效應(yīng)能被NF-κB信號(hào)阻斷劑所抑制。為進(jìn)一步驗(yàn)證熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果的可靠性，我們將滅活后的大腸桿菌注射到5齡3天家蠶大造(p50)品系中，12h后提取誘導(dǎo)處理家蠶的脂肪體組織，從中得到脂肪體組織的核蛋白，根據(jù)BmCPT1基因中含有的NF-κB序列設(shè)計(jì)標(biāo)記探針與突變探針，進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，證實(shí)家蠶的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子BmRelish1能夠結(jié)合到BmCPT1基因上游啟動(dòng)子的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)上，說明LPS對BmCP