IKKβ誘導(dǎo)表達(dá)及其介導(dǎo)的TFF3激活NF-κB通路機制初探.pdf

1、腸三葉因子3（TrefoilFactor3，TFF3）是三葉因子家族的成員，廣泛表達(dá)于哺乳動物的多種組織，對粘膜上皮有保護和修復(fù)作用，是一種調(diào)節(jié)性小肽。有研究表明，在炎癥、癌癥等病理狀態(tài)下，TFF3的表達(dá)上調(diào)。TFF3除了作為一種粘膜保護肽，對上皮組織起到修復(fù)損傷作用外，近期發(fā)現(xiàn)它參與包括NF-κB等信號通路的調(diào)節(jié)。
　　 核因子κB（NuclearFactor-kappaB，NF-κB），作為核轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)環(huán)境刺激，也做為一

2、種關(guān)鍵的信號中樞調(diào)節(jié)多種病理、生理反應(yīng)。研究表明NF-κB參與調(diào)節(jié)多種涉及固有免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的細(xì)胞因子、生長因子和酶效應(yīng)子的表達(dá)，包括T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體、TNFR、CD40、BAFFR、LTβR以及Toll/IL-1R家族成員。體內(nèi)外的多種刺激通過不同的受體、受體近端分子、接頭蛋白（如TRAFs、RIPs）等分子的介導(dǎo)，激活上游激酶復(fù)合物IKKs，從而引起抑止子IκBs的磷酸化、降解，釋放出游離的NF-κB調(diào)節(jié)一系列靶基因的表

3、達(dá)。不同的刺激因素可能以刺激特異性方式誘導(dǎo)IKKs復(fù)合物的激活，活化NF-κB通路。
　　 TFF3調(diào)節(jié)的NF-κB信號通路分子可能成為治療免疫炎癥相關(guān)疾病的新靶點，因此，明確TFF3激活NF-κB信號途徑的分子機制具有非常重要的理論和臨床意義。本研究報道了TFF3可能調(diào)節(jié)的NF-κB上游IκB激酶復(fù)合物亞基分子的變化，為明確TFF3激活NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)機制提供了新的依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.

4、pGEX-5x-1-IKKβ載體構(gòu)建及原核表達(dá)、純化
　　 以M6P8載體為模板，PCR獲得IKKβ片段。用T4DNA連接酶，在4℃下進行酶切后的DNA片段和載體的連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化至DH5α菌株中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，提取質(zhì)粒、酶切鑒定，并測序。
　　 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)菌中，培養(yǎng)過夜，第二天以1:100接種至200mlLB，培養(yǎng)至OD600值至0.6-1.0，提取細(xì)菌蛋白，并純化。
　　 2.p

5、EGFP-TFF3重組載體的構(gòu)建
　　 提取細(xì)胞RNA后RT-PCR獲得hTFF3片段，酶切后連接至pEGFP載體中，酶切、測序鑒定。
　　 3.TFF3誘導(dǎo)下對IKKβ的表達(dá)調(diào)節(jié)作用
　　 轉(zhuǎn)染pEGF-TFF3載體，以RT-PCR、WesternBlot檢測IKKβ在TFF3誘導(dǎo)前后的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.IKKβ蛋白在原核細(xì)胞中的表達(dá)純化
　　 SDS-PAGE凝膠電泳

6、檢測IPTG誘導(dǎo)E.coliBL21蛋白表達(dá)，在73kD處純化得到融合蛋白條帶，與預(yù)期的蛋白分子量一致。
　　 2.pEGFP-C1-TFF3、pGEX-5x-1-IKKβ重組載體的構(gòu)建及鑒定
　　 構(gòu)建了pEGFP-C1-TFF3、pGEX-5x-1-IKKβ重組載體，經(jīng)雙酶切、測序結(jié)果顯示酶切結(jié)果與預(yù)期片段分子量一致，測序結(jié)果與GenBank中TFF3、IKKβ的基因序列一致，證實載體構(gòu)建成功。
　　 3.T

7、FF3調(diào)節(jié)IKKβ分子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)
　　 發(fā)現(xiàn)IKKβ分子在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均的表達(dá)受TFF3調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論：
　　 TFF3調(diào)節(jié)IκB激酶亞基分子IKKβ的表達(dá)，提示IKKβ分子參與TFF3激活的NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)，結(jié)果為TFF3在激活NF-κB中的作用提供了新的線索。本實驗構(gòu)建了pEGFP-C1-TFF3及p6EX-5x-1-IKKβ重組載體，并在原核細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了IKKβ分子的表達(dá)和純化，為