鴨坦布蘇病毒激活NF-κB并誘導(dǎo)IFn-β的信號(hào)通路的分子機(jī)制研究.pdf

1、鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)是2010年以來(lái)新出現(xiàn)的一種黃病毒科黃病毒屬病毒，給我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。DTMUV感染的病鴨臨床表現(xiàn)出厭食、萎靡不振、腹瀉和蛋鴨產(chǎn)蛋量下降等癥狀，目前對(duì)其致病的機(jī)理并不清楚。DTMUV可以被宿主的模式識(shí)別受體（Pattern Recognition Receptors，PRRs）識(shí)別，通過(guò)一系列的信號(hào)通路激活NF-κB并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β，進(jìn)而誘導(dǎo)抗病毒的天然

2、免疫反應(yīng)。然而大量IFN-β的表達(dá)能誘導(dǎo)過(guò)量的炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，造成機(jī)體嚴(yán)重的病理?yè)p傷。本研究首次克隆了鴨TRAF6基因并分析了其在鴨天然免疫的作用，積累了一些研究鴨天然免疫反應(yīng)的研究方法和技術(shù)手段，完善了本實(shí)驗(yàn)室鴨的天然免疫的研究平臺(tái)。在此基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分析了DTMUV激活I(lǐng)FN-β的分子機(jī)制，為揭示DTMUV引起天然免疫反應(yīng)和炎癥損傷機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:
　　1.鴨TRAF6的克隆與功能研究
　　本研究

3、首次克隆了鴨TRAF6(duTRAF6)的全長(zhǎng)eDNA(GenBankK J461514.1)。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)duTRAF6與鳥(niǎo)類(lèi)的進(jìn)化關(guān)系最近。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)duTRAF6在鴨的脾臟、結(jié)腸、肌肉中表達(dá)豐度較高。通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)duTRAF6可以激活NF-κB且呈劑量依賴(lài)現(xiàn)象。通過(guò)構(gòu)建一系列的duTRAF6突變體，發(fā)現(xiàn)zinc fingers結(jié)構(gòu)域和coiled-coil結(jié)構(gòu)域是duTRAF6

4、激活NF-κB的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。siRNA干擾試驗(yàn)進(jìn)一步證明duTRAF6在NF-κB信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用。該部分的研究為下面的研究積累了可靠的研究方法和關(guān)鍵的技術(shù)手段。
　　2.DTMUV感染DEFs通過(guò)RIG-Ⅰ、MDA5、TLR3和MAVS激活NF-κB、IRF1并誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生
　　通過(guò)RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)DTMUV感染后IFN-α/β/γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17、I

5、L-18、TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示DTMUV的感染可以激活DEFs的天然免疫反應(yīng)。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)DTMUV感染顯著地激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、IRF1并誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-β，且呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。為了揭示DTMUV誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的分子機(jī)制，本研究通過(guò)超表達(dá)RIG-Ⅰ、MDA5的負(fù)調(diào)控突變體和轉(zhuǎn)染TLR3、MAVS的siRNA分子分別對(duì)RIG-Ⅰ、MDA5和TLR3信號(hào)通路進(jìn)行阻斷，發(fā)現(xiàn)干擾這些通路后，DTMU

6、V對(duì)IFN-β的激活顯著降低，表明RIG-Ⅰ、MDA5和TLR3信號(hào)通路參與了DTMUV誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。
　　3.DTMUV編碼的NS5蛋白顯著激活NF-κB、IRF1并誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生
　　為了進(jìn)一步研究DTMUV編碼的蛋白誘導(dǎo)IFN-β的作用，本研究通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)DTMUV編碼的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DTMUV編碼的NS5蛋白可以通過(guò)激活NF-κB、IRF1誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。通過(guò)構(gòu)建N

7、S5蛋白的截短及點(diǎn)突變突變體，發(fā)現(xiàn)缺失了NLR(Nnuclear Localization Region)功能區(qū)和MTase(Methyltransferase)功能區(qū)的NS5(aa45-905)、NS5(aa224-905)截短突變體仍然能夠顯著地誘導(dǎo)IFN-β，而突變了RdRp活性位點(diǎn)的突變體NS5(D668A)和NS5(D536A)完全喪失了激活I(lǐng)FN-β的能力，提示NS5蛋白的RdRp活性與NS5誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生密切相關(guān)。<

8、br>　　4.MDA5、MAVS、MyD88和TRIF參與NS5蛋白誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生
　　為了揭示NS5蛋白誘導(dǎo)IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路，本研究在DF1細(xì)胞中通過(guò)siRNA對(duì)MDA5、MAVS、TRIF和MyD88進(jìn)行基因沉默，發(fā)現(xiàn)干擾MDA5、MAVS、MyD88、TRIF后，NS5蛋白對(duì)IFN-β的激活顯著降低，表明MDA5、MAVS、MyD88、TRIF參與了NS5蛋白誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。
　　綜上所述，本研究首