乙型肝炎病毒（HBV）拮抗IFN-α信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)是困擾我國(guó)人民健康的重要傳染性疾病，其中相當(dāng)一部份發(fā)展成為慢性乙型肝炎，有些還可能進(jìn)一步演變?yōu)楦斡不?、肝?xì)胞癌等。目前臨床上常使用拉咪呋叮(3TC)與干擾素-α(IFN-α)治療慢性活動(dòng)性乙型肝炎。其中3TC是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制物，能顯著下調(diào)患者體內(nèi)病毒核酸水平；而IFN-α是一類(lèi)同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒作用的細(xì)胞因子類(lèi)藥物，臨床資料表明IFN-α能下調(diào)病毒蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，促進(jìn)抗體

2、產(chǎn)生，但是有效率不到40％。對(duì)HBV能否拮抗以及如何拮抗IFN-α抗病毒效應(yīng)，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外眾多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了研究并已獲得具有一定意義的結(jié)果，如發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)IFN-α反應(yīng)性明顯弱于健康對(duì)照，MxA蛋白誘生障礙；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBV前Core或Core蛋白可結(jié)合MxA基因上游啟動(dòng)子，從而抑制MxA蛋白表達(dá)。另外對(duì)IFN-α耐藥的乙型肝炎患者先使用3TC降低病毒滴度后再給予IFN-α治療，可以提高IFN-α療效。以上結(jié)

3、果提示HBV與IFN-α間存在相互作用，而且這種相互作用可能是多方面的?？梢酝茰y(cè)HBV可能通過(guò)病毒復(fù)制和蛋白表達(dá)對(duì)干擾素誘生與效應(yīng)信號(hào)通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，使內(nèi)源性干擾素產(chǎn)生不足或干擾素抗病毒效應(yīng)被拮抗，從而導(dǎo)致感染慢性化以及對(duì)IFN-α的治療不敏感。多角度深入研究HBV與IFN-α相互作用的機(jī)制有可能有助于加深對(duì)HBV慢性感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)。為此，本課題擬利用體外HBV穩(wěn)定和短暫復(fù)制細(xì)胞系統(tǒng)，通過(guò)改變HBV復(fù)制狀態(tài)，比較HBV不同復(fù)制

4、水平下細(xì)胞內(nèi)IFN信號(hào)通路與相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的變化以揭示HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)對(duì)干擾素相關(guān)信號(hào)通路的影響，并初步探索其分子機(jī)制。 本研究首先建立了可模擬HBV不同復(fù)制和蛋白表達(dá)水平的細(xì)胞系統(tǒng)，包括經(jīng)3TC處理的原可持續(xù)分泌病毒抗原和進(jìn)行病毒基因復(fù)制的HepG2.2.2.15、瞬轉(zhuǎn)具有不同復(fù)制能力的HBV質(zhì)粒和編碼病毒Pol蛋白質(zhì)粒的Huh-7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3TC可明顯抑制HepG2．2．2．15細(xì)胞內(nèi)病毒核酸復(fù)制，對(duì)Core蛋白

5、水平也有一定程度的抑制作用，但對(duì)病毒的S抗原、E抗原等病毒蛋白無(wú)明顯抑制作用；野生型HBV質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可啟始HBV基因復(fù)制，HBV復(fù)制缺陷型HBV質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)則不發(fā)生HBV基因的復(fù)制。 在此基礎(chǔ)上，對(duì)HBV不同復(fù)制水平下細(xì)胞內(nèi)IFN信號(hào)通路與相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在3TC處理后、HBV基因復(fù)制受到明顯抑制的情況下，HepG2．2．2．15細(xì)胞對(duì)IFN-α刺激的反應(yīng)性可得到不同程度恢復(fù)，表現(xiàn)為內(nèi)源性ISGs表

6、達(dá)上調(diào)，IFN信號(hào)通路熒光報(bào)告系統(tǒng)指示信號(hào)通路活化強(qiáng)度變大，提示HBV復(fù)制與細(xì)胞對(duì)IFN-α的反應(yīng)性存在一定相關(guān)性。進(jìn)一步應(yīng)用瞬轉(zhuǎn)兩種具有完全不同復(fù)制能力HBV質(zhì)粒的細(xì)胞比較其對(duì)IFN-α的反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)制缺陷型HBV對(duì)IFN-α信號(hào)通路誘導(dǎo)表達(dá)的熒光酶的抑制效應(yīng)弱于野生型HBV，但恢復(fù)其復(fù)制能力后抑制IFN-α信號(hào)通路的效應(yīng)仍可得到加強(qiáng)，進(jìn)一步提示在HBV拮抗IFN系統(tǒng)的作用中，病毒基因復(fù)制因素可能發(fā)揮重要作用。由于在HBV基因復(fù)

7、制受到抑制時(shí)Core蛋白的水平也出現(xiàn)一定程度下降，而體外單獨(dú)瞬轉(zhuǎn)HBV復(fù)制酶Pol也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)IFN-α的應(yīng)答性亦出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可以推測(cè)HBV的Core蛋白和病毒復(fù)制酶Pol均可能參與HBV對(duì)IFN信號(hào)通路的拮抗作用。為明確HBV對(duì)IFN信號(hào)通路中JAK-STAT信號(hào)通路的影響，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了不同HBV復(fù)制水平的細(xì)胞中STAT1蛋白的表達(dá)及磷酸化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與未處理組相比，3TC處理后、HBV基因復(fù)制受到明顯抑制的HepG2．2

8、．2．15細(xì)胞在受IFN-α刺激后其STAT1蛋白表達(dá)以及磷酸化水平并未得到顯著加強(qiáng)，這提示HBV抑制IFN-α信號(hào)通路的作用可能通過(guò)其它環(huán)節(jié)進(jìn)行。 綜上所述，本研究結(jié)果表明HBV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)可干擾IFN誘發(fā)的信號(hào)通路，其中Core蛋白和病毒復(fù)制酶Pol可能發(fā)揮了重要作用。然而這一干擾作用可能與STAT1誘導(dǎo)性表達(dá)及其磷酸化水平無(wú)關(guān)，提示IFN-α信號(hào)通路的其它環(huán)節(jié)可能受到影響。對(duì)此現(xiàn)象的深入研究有可能揭示HBV拮抗干擾素的分