乙型肝炎病毒X蛋白抑制Wnt信號通路拮抗因子SFRPs的表達(dá)及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第三大導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤。HCC發(fā)生的其中一個(gè)危險(xiǎn)因素是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染。目前全世界約有4億人感染HBV，中國約占1/3。HBV基因組由部分環(huán)狀的雙鏈DNA組成，全長約為3.2kb，基因組包含4個(gè)開放閱讀框架，分別為C、P、S和X區(qū)。乙型肝炎病毒X基因（Hepatitis B virus X,HBx）編碼15

2、4個(gè)氨基酸，在病毒的復(fù)制等方面發(fā)揮重要作用。大量的研究報(bào)道表明，HBx蛋白在HCC的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用。作為一個(gè)多功能的調(diào)節(jié)因子，HBx能夠和細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性。此外，HBx還可涉及一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，例如:Wnt/β-catenin, Ras/MAPK，SAPK/JNK，NF-κB，F(xiàn)AK等。
　　Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控著細(xì)胞的衰老、死亡、增殖、轉(zhuǎn)移，以及在決定胚胎形態(tài)等方面都發(fā)揮

3、著重要的作用。大量的研究表明，Wnt信號通路的異?；罨梢詤⑴c腫瘤的發(fā)生，例如:肺癌、結(jié)腸癌等。以前也有研究表明，Wnt信號通路的異?；罨部蓪?dǎo)致肝癌的發(fā)生。在肝癌的發(fā)生中，除了Wnt/β-catenin信號通路組成部分的基因突變外，一些表觀遺傳修飾也可導(dǎo)致這條信號通路的異?；罨?。分泌卷曲相關(guān)蛋白(Secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是一種Wnt信號的拮抗因子。SFRPs家族共有5個(gè)分泌性糖

4、蛋白家族成員，包括SFRP1～5，由約300個(gè)氨基酸殘基組成。有研究報(bào)道表明，由于SFRPs啟動子區(qū)甲基化導(dǎo)致其表達(dá)的下調(diào)，在HBV相關(guān)的HCC中發(fā)揮重要作用。相反，回復(fù)SFRP1的表達(dá)，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。這些數(shù)據(jù)表明，SFRPs基因的表觀沉默表達(dá)，在由Wnt/β-catenin信號通路異?；罨瘜?dǎo)致的HCC中發(fā)揮重要作用。
　　也有研究報(bào)道表明，HBx也能夠激活Wnt/β-catenin這條信號通路，但是其在表

5、觀沉默SFRPs從而導(dǎo)致肝癌的發(fā)生等方面，目前還未見相關(guān)的報(bào)道。本研究擬在細(xì)胞水平和腫瘤組織標(biāo)本中觀察HBx對SFRPs的表觀調(diào)控，從而進(jìn)一步研究HBx導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制。
　　方法:收集臨床肝癌組織標(biāo)本，提取癌組織DNA、RNA和總蛋白，通過RT-PCR、western blot檢測腫瘤組織與癌旁組織中SFRP1和SFRP5的表達(dá)情況，進(jìn)一步采用甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)及

6、亞硫酸鹽測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP），檢測肝癌組織中SFRP1、SFRP啟動子區(qū)的甲基化表達(dá)情況。同時(shí)觀察感染HBx的腫瘤細(xì)胞株SFRP1、SFRP5啟動子活性變化，進(jìn)一步證實(shí)HBx能否調(diào)控SFRP1、SFRP5的表達(dá)。通過體外功能實(shí)驗(yàn)研究回復(fù)SFRP1、SFRP5或干擾甲基化修飾酶Dnmt1后肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力變化，探討HBx蛋白調(diào)控SFRP1、SFRP5的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:

7、我們在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收集到35例原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本，分別提取腫瘤和癌旁組織的總RNA、DNA、總蛋白，觀察到與癌旁組織相比，腫瘤組織Wnt信號抑制分子SFRP1、SFRP5的表達(dá)明顯下調(diào)，甲基化特異性PCR以及亞硫酸鹽測序PCR實(shí)驗(yàn)均表明腫瘤組織與癌旁組織相比，SFRP1和SFRP5啟動子區(qū)甲基化修飾顯著增高。體外構(gòu)建成功含SFRP1和SFRP5區(qū)的啟動子截短突變報(bào)告質(zhì)粒，采用雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測，結(jié)果表明SFRP1、SF

8、RP5啟動子區(qū)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)400bp左右啟動子活性最強(qiáng)。感染HBx后，SFRP1、SFRP5的啟動子活性明顯低于對照組。在體外功能實(shí)驗(yàn)中，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTS實(shí)驗(yàn)、Brdu摻入實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)均可證實(shí)，穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝癌細(xì)胞系，HBx蛋白可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，并且干擾Dnmt1或者回復(fù)SFRP1、SFRP5能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖作用。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBx蛋白能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞的遷移的能力，干擾Dnmt1或者回