髓樣細胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒復制的機制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B vires,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae),具有獨特的基因組結構及生物學特性。由HBV感染引起的乙型肝炎是嚴重危害人類健康的疾病。目前,臨床上針對HBV感染的抗病毒藥物主要為核苷類似物和干擾素-α(Interferon-α,IFN-α)。IFN-α的抗HBV的機制以及相關的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的生物學功能尚未完全闡明。我們

2、和其他實驗室以前的研究結果顯示,髓樣細胞分化蛋白88(Myeloiddifferentiation primary response protein88,MyD88)的表達能被干擾素誘導,并且在肝腫瘤細胞中能通過激活NF-κB抑制HBV的復制。與此同時,HBV編碼的聚合酶蛋白通過抑制statl的入核下調MyD88啟動子活性從而抑制干擾素誘導的MyD88的表達。這些結果提示,MyD88可能在干擾素抑制ItBV復制中發(fā)揮關鍵作用。但是MyD

3、88的抗病毒機制仍不甚明了,有必要進一步研究其詳細的作用機制。
　　為了進一步驗證MyD88的抗病毒作用,首先用MyD88重組腺病毒(Ad-MyD88)感染有穩(wěn)定HBV復制的HepG2.2.15細胞,然后用Northern-blot和Southem-blot檢測病毒:RNA和病毒核心顆粒相關DNA水平。結果顯示,與對照相比,Ad-MyD88感染同等程度地降低了病毒RNA和核心顆粒相關DNA的水平,提示MyD88抗病毒作用的一級靶位

4、點可能是病毒RNA,這一點隨后用只能進行病毒RNA的轉錄而不能進行病毒基因組復制的pCIdA-HBV所證實。此外在通過小鼠尾靜脈高壓注射HBV復制質粒建立的急性感染模型中,MyD88也具有與在體外相似的抗病毒作用。
　　為了探討是否MyD88在生理條件下也能發(fā)揮抗病毒作用,將MyD88 siRNA轉入Huh7細胞,然后測定IFN-α的抗病毒活性。結果顯示,在MyD88 knock-down細胞中,HBV對IFN-α的抗病毒作用有了

5、一定的抵抗能力,提示MyD88在IFN-α抑制HBV復制中發(fā)揮一定作用。
　　MyD88能直接下調病毒RNA水平,這可能發(fā)生在轉錄水平,也可能發(fā)生在轉錄后水平。結果顯示,MyD88對由HBV啟動子和增強子調控的熒光素酶的活性沒有顯著影響,但是能抑制受CMV啟動子啟動的pregenomic RNA的水平。這些結果提示,MyD88下調病毒RNA水平是一轉錄后水平事件。
　　為了進一步研究MyD88轉錄后下調pregenomic

6、RNA的機制,利用Tet-off系統(tǒng)研究MyDS8對pregenomic RNA穩(wěn)定性的影響。結果顯示MyD88可以降低pregenomic RNA的穩(wěn)定性。進一步通過核漿分離顯示,MyD88降低了pregenomicRNA在胞漿中的穩(wěn)定性,但是對胞核中pregenomic RNA的穩(wěn)定性沒有影響。RNA干擾實驗表明,MyD88對pregenomic RNA在胞漿中的降解是通過細胞中的兩條mRNA降解通路即5'-3' mRNA降解通路和

7、3'-5'mRNA降解通路進行。
　　細胞蛋白La可與HBVpregenomic RNA特異結合促進pregenomic RNA的穩(wěn)定性。但是本研究顯示,MyD88誘導pregenomic RNA的降解不依賴于La蛋白與pregenomic RNA的相互作用。進一步通過mapping分析發(fā)現HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)是MyD88的應答序列。隨后以pregenomie RNA為背景,構建HBV(180

8、4-2454)和HBV(1151-1684)的缺失突變體,然后測定它們對MyD88的敏感性。結果顯示,HBV(1151-1684)的缺失突變體仍然保留著對MyD88的應答能力,而HBV(1804-2454)的缺失突變體喪失了對MyD88的敏感性,表明位于HBV pregenomic RNA5'末端的HBV(1804-2454)序列為MyD88誘導pegenomic RNA降解的一個關鍵的順式作用序列。
　　RNA序列HBV(115

9、1-1684)位于HBV pregenomic RNA和preS/S RNAs的重疊區(qū)域,因此它可能選擇性賦予了preS/S RNAs對MyD88的敏感性。結果顯示,RNA序列HBV(1151-1684)選擇性介導了HBV preS/S RNA的降解,并且這種降解主要發(fā)生在核內。
　　有趣的是RNA序列HBV(1151-1684)與HBV轉錄后調控元件(posttranscriptional regulatory,element,

10、PRE)完全重疊。HBV PRE選擇性介導preS2/S RNAs出核,不能出核的RNA最后以一種未知的機制在核中降解。因此MyD88導致preS/S RNAs在核中降解可能是由于MyD88干擾了PRE介導的preS/S RNAs出核所導致。通過CAT活性分析顯示,MyD88可以降低PRE介導的CAT活性,并且不是由于MyD88直接導致其在核中降解所造成,因為在PRE出核抑制蛋白NES(-)RanBP1共表達的條件下,MyD88不能進一

11、步抑制CAT的活性,而PRE的核輸出因子多嘧啶莖結合蛋白(polypyrimidne tract-bindingprotein,PTB)的表達幾乎完全恢復了PRE促進出核的功能。隨后通過核漿分離用Northem-blot證實了CAT活性分析的結果。因此,從以上結果可以得出MyD88抑制了PRE介導的preS2/S RNAs出核。
　　為了進一步研究MyD88抑制PRE介導的preS/S RNAs出核機制,檢測了PTB的表達水平。結