乙型肝炎病毒X蛋白對肝癌細(xì)胞生長、增殖的調(diào)控及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染者已超過3.5億人，并呈上升趨勢，主要分布在亞洲和非洲，每年大約有一百萬人死于HBV相關(guān)的肝臟疾病。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡率第二位，嚴(yán)重威脅著人們的健康。HBV感染是肝癌發(fā)生的主要原因之一，流行病學(xué)調(diào)查表明，HBV感染者發(fā)生HCC的幾率較正常人高100倍，但HBV致

2、癌的具體機(jī)制尚不明確。 乙型肝炎病毒X基因編碼的X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)是一種多功能病毒調(diào)節(jié)蛋白，具有廣泛的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并能與宿主細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)與細(xì)胞蛋白質(zhì)功能，進(jìn)而影響病毒自身的復(fù)制、宿主細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡等重要過程，HBx的這些功能可能在HBV相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，但其確切機(jī)制目前尚不太清楚，有待于進(jìn)一步

3、研究闡明。 研究表明細(xì)胞癌變與細(xì)胞周期失控密切相關(guān)，典型細(xì)胞周期包括有嚴(yán)格順序的5個期即GO(靜止期)→G1(合成前期)→S(合成期)→G2(合成后期)→M(分裂期)。細(xì)胞周期正常進(jìn)行的關(guān)鍵在于細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶家中山大學(xué)碩士學(xué)位論文乙型肝炎病毒X蛋白對肝癌細(xì)胞生長、增殖的調(diào)控及機(jī)制研究族(CDKs)的活化，而CDKs受細(xì)胞周期素(cyclin)及其抑制蛋白的正負(fù)調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)的8種cyclin中，尤以cyclin D家族

4、對細(xì)胞增殖具有最重要的意義，實驗表明，阻滯cyclin D的表達(dá)則細(xì)胞不能從G1期→S期，而其過表達(dá)則G1期縮短。當(dāng)G1期縮短，細(xì)胞生長加速，并使得DNA受到損傷的細(xì)胞無法得到有效修復(fù)，從而可能發(fā)生腫瘤。 p16為抑癌基因，屬于周期依賴性激酶抑制因子(CDKI)基因家族，定位于人染色體9p21，編碼的P16蛋白為CDK4/6抑制劑，對CDK4/6有高度親和性，在細(xì)胞增殖的調(diào)控中，P16蛋白與cyclin D1競爭與CDK4/6結(jié)合，對細(xì)

5、胞周期發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。通過此作用阻止細(xì)胞周期通過G1/S檢驗點，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡、阻止有DNA損傷的細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖中具有關(guān)鍵的作用。P16蛋白的失活可導(dǎo)致細(xì)胞周期縮短，生長加快。 DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。在哺乳動物,DNA甲基化主要發(fā)生在5’-CpG-3’的C上，生成5-

6、甲基胞嘧啶(5mC)。DNA甲基化是基因表達(dá)降低或缺如的主要機(jī)制，是調(diào)控基因表達(dá)的重要方式。正常的甲基化在維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性、維持細(xì)胞和器官正常功能及個體的發(fā)育、分化、生長、衰老起著重要作用，而異常甲基化導(dǎo)致一些抑癌基因及生長調(diào)控基因失活從而在腫瘤形成中起了重要作用。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象是指雙鏈RNA誘導(dǎo)同源mRNA降解從而導(dǎo)致基因表達(dá)降低或缺如的現(xiàn)象，又稱為基因沉默。利用RNAi的

7、這種特性，可以設(shè)計與已知基因mRNA同源的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，導(dǎo)入細(xì)胞或動物體內(nèi)，使特定基因表達(dá)沉默。 研究目的：1、了解HBV X蛋白對肝癌細(xì)胞周期、生長的調(diào)控作用及機(jī)制。2、探討HBV X蛋白是否通過影響p16基因甲基化而調(diào)控肝癌細(xì)胞生長、增殖。 實驗方法: 以穩(wěn)定表達(dá)GFP/HBV X融合蛋白的HepG2細(xì)胞系(HepG2/GFP-HBx)和自然整合有HB

8、V DNA及表達(dá)HBV X蛋白的亞歷山大肝癌細(xì)胞(PLC/PRF/5)作為本課題的實驗系統(tǒng)。設(shè)計、合成靶向adr、adw亞型HBV X基因的小分子干擾RNA(X-siRNA-1，X-siRNA-2)及非特異性neg-siRNA。將各siRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞，半定量RT-PCR檢測HBV X基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，MTT法檢測各種因素處理肝癌細(xì)胞的生長情況。應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2’-脫氧胞苷(5

9、umol/1)處理HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測各siRNA轉(zhuǎn)染及5-氮-2’-脫氧胞苷處理的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，甲基化PCR(MSP)檢測各組細(xì)胞p16基因甲基化情況。采用阿霉素(Addamycin Adr)(2.0ug/ml)分別處理HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞，阿霉素處理后36小時，TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡情況。采用SPSS 10.0統(tǒng)計

10、軟件，兩組問差異用χ2檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 實驗結(jié)果: MTT檢測表明與HepG2和HepG2-GFP組相比，HepG2-GFP/χ組細(xì)胞生長速度加快，指數(shù)生長期提前。RT-PCR檢測示，X-siRNA-1、X-siRNA-2轉(zhuǎn)染的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞，HBV X基因mRNA電泳條帶的相對灰度值分別為0.30±0.04、0.21±0.04，較空白對照細(xì)胞及neg-siRN

11、A的(1.01±0.03、0.91±0.01)和(1.13±0.03、1.09±0.06)顯著降低(P<0.05)，同時，MTT法檢測顯示X-siRNA-1、X-siRNA-2轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞生長減慢。流式細(xì)胞術(shù)檢測示HepG2/GFP-HBx細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比(16.22±0.45)％，較HepG2、HepG2/GFP的(45.11±1.21)％、(41.25±1.46)％顯著減少(P<0.05)，細(xì)胞分裂周期縮短。HBV X特

12、異性siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞G0/G1期分別為(36.924±1.15)％、(65.46±2.09)％，較空白對照細(xì)胞組(16.22±0.45)％、(47.50±1.46)％顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞阻滯于G0/G1期，細(xì)胞分裂周期延長。甲基化抑制劑5-氮-21-脫氧胞苷處理后HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比分別達(dá)到(33.09±0.92)％、(57.

13、96±2.16)％，較空白對照組細(xì)胞增加(P<0.05)，而5-氮-21-脫氧胞苷處理后，HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比分別是(44.85±1.54)％、(41.05±1.52)中山大學(xué)碩士學(xué)位論文乙型肝炎病毒X蛋白對肝癌細(xì)胞生長、增殖的調(diào)控及機(jī)制研究％，較空白對照組無明顯差異(P>0.05)。 MSP檢測表明，表達(dá)GFP/HBx融合蛋白、HBx的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞出現(xiàn)了p1

14、6基因甲基化，不表達(dá)HBx的對照細(xì)胞未見可檢測的p16基因甲基化；靶向HBV X的siRNA轉(zhuǎn)染及5-氮-21-脫氧胞苷處理的HepG2/GFP-HBx、PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞p16基因甲基化降低。 TUNEL法檢測顯示，阿霉素處理36小時后HepG2、HepG2/GFP細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡，凋亡率分別為(57.2±2.2)％、(59.4±2.5)％，明顯高于HepG2/GFP-HBx細(xì)胞(3.9±0.6)％及未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞(2

15、.1±0.4)％、(2.7±0.5)％、(2.9±0.4)％(P<0.05)。而在轉(zhuǎn)染了X-siRNA-1的HepG2/GFP-HBx細(xì)胞，阿霉素處理36小時后出現(xiàn)了明顯的凋亡(55.6±2.7)％，明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及neg-siRNA轉(zhuǎn)染的HepG2/GFP-HBx細(xì)胞(4.1±0.4)％，與對照細(xì)胞無明顯差別(P>0.05)。表明特異性靶向HBV X的siRNA可以逆轉(zhuǎn)HBV X的抗凋亡作用。阿霉素處理36小時后PLC/PRF/5

16、細(xì)胞的凋亡率僅為(1.7±0.3)％，與空白對照組細(xì)胞凋亡率(1.4±O．3)％無明顯差別(P>0.05)。而在轉(zhuǎn)染了X-siRNA-2的PLC/PRF/5細(xì)胞，阿霉素處理36小時后出現(xiàn)了明顯的凋亡，凋亡率達(dá)(67.0±3.0)％，與未轉(zhuǎn)染組有明顯差別(P<0.05)。但在轉(zhuǎn)染了neg-siRNA的PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞，阿霉素處理36小時后未出現(xiàn)明顯的凋亡，凋亡率為(4.0±0.3)％，與空白對照組細(xì)胞無明顯差別(P>0.05)。