乙型肝炎病毒X蛋白誘發(fā)肝細胞惡性轉(zhuǎn)化機制的定量蛋白組學(xué)研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤中發(fā)病率居第五、致死率居第三的惡性疾病。每年全世界約有700，000例新增患者，其中男性發(fā)病率遠遠高于女性，且主要集中于東南亞地區(qū)以及非洲撒哈拉沙漠以南區(qū)域，呈現(xiàn)顯著的地域性分布。中國大陸地區(qū)HCC患者數(shù)量占全世界患者數(shù)量的50％，其中男性發(fā)病率為35.2/100，000，女性發(fā)病率為13.3/100，000。病因?qū)W統(tǒng)計顯示54％的HCC患者與

2、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染關(guān)系密切。雖然HBV疫苗的強制接種使目前中國HBV病毒感染者數(shù)量由9.75％降到7.18％，但由于人口基數(shù)龐大以及已有感染者發(fā)生HCC的滯后效應(yīng)等因素的影響，HBV患者的治療和預(yù)防依然是中國社會亟待解決的公共衛(wèi)生安全問題。
　　HBV基因編碼四種蛋白，包括表面抗原HBsAg、核心區(qū)蛋白(HBeAg和HBcAg)、病毒DNA聚合酶HBp以及HBx。其中HBx是一種多功能的

3、病毒調(diào)節(jié)因子，具有促進肝細胞轉(zhuǎn)化為肝細胞癌的功能。近年來通過酵母雙雜交、染色質(zhì)免疫共沉淀、表達譜芯片分析以及蛋白質(zhì)免疫共沉淀等技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBx主要參與調(diào)節(jié)病毒與宿主細胞基因的轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和蛋白質(zhì)降解水平等多個生物學(xué)過程，進一步證實了HBx基因功能的復(fù)雜性和多樣性。盡管在HBx基因功能研究中取得較大成績，但是在研究的策略、實驗?zāi)Ｐ鸵约澳Ｐ偷募膊顟B(tài)方面存在諸多不足。主要體現(xiàn)為研究策略局限于局部的信號或代謝通路，缺乏系統(tǒng)性、整體性的分析

4、，或者僅有基因mRNA水平的系統(tǒng)評價，缺少蛋白質(zhì)水平的系統(tǒng)分析;實驗?zāi)Ｐ投嘁曰颊呓M織樣本或體外培養(yǎng)的細胞系為主，忽視了細胞微環(huán)境和遺傳異質(zhì)性等要素對于HBx致病機制研究的干擾。此外，HBx引發(fā)的從肝臟炎癥并發(fā)展至癌癥的進程中的作用機制并沒有得到清晰的闡釋。
　　本研究旨在利用高覆蓋、高精度的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化的病理生理學(xué)機制。研究依托HBx轉(zhuǎn)基因致肝癌小鼠模型，選擇分別代表HBx誘發(fā)的肝臟炎癥與

5、癌癥病理狀態(tài)的12個月(12M)和24個月(24M)的組織作為實驗材料，以HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的同窩正常小鼠作為實驗對照，以避免遺傳背景和外界環(huán)境對HBx基因功能研究的干擾。選用實驗室制備的重穩(wěn)定性同位素標記氨基酸完全標記的小鼠作為定量內(nèi)標，實現(xiàn)高精度蛋白質(zhì)組定量。同時，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選與HBx發(fā)生相互作用的關(guān)鍵分子。以“與HBx相互作用蛋白”為中心點結(jié)合定量蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，重構(gòu)“HBx-結(jié)合蛋白-信號效應(yīng)”的

6、HBx網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖。
　　本研究在國內(nèi)首次發(fā)展了用于小鼠模型的SILAC整體標記方法。利用含有重穩(wěn)定性同位素標記賴氨酸([13C6]-Lysine)的SILAC鼠糧飼養(yǎng)C57BL/6小鼠，實現(xiàn)代謝過程中的小鼠蛋白質(zhì)組高標記。對不同器官組織樣品進行標記效率的LC-MS/MS定量分析，證明F2代小鼠的整體標記效率達到95％以上。其中用于HBx小鼠實驗中的F2代SILAC小鼠肝臟標記效率達到96.34％±0.90％，這為高精度定量蛋白質(zhì)組

7、學(xué)研究創(chuàng)造了條件。
　　在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究中，我們共鑒定到162個與HBx相互作用的蛋白。GO分析顯示這些蛋白質(zhì)涉及細胞骨架重構(gòu)、線粒體組份、脂代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期調(diào)控和RNA可變剪接等諸多過程。其中47個已經(jīng)被以前的研究證實，占鑒定的162個相互作用蛋白的近30％，顯示了蛋白質(zhì)組學(xué)在研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的可行性。剩余的115個蛋白質(zhì)為首次鑒定的和HBx相互作用的蛋白質(zhì)，體現(xiàn)了我們蛋白質(zhì)組檢測平臺的靈敏度和高

8、覆蓋蛋白質(zhì)組技術(shù)的優(yōu)勢。在這162個HBx相互作用蛋白中，最大的群體是細胞骨架相關(guān)蛋白。共有37個蛋白質(zhì)屬于這個類群，包括肌凝蛋白MYL6B、肌動蛋白相關(guān)蛋白ACTR3B、連環(huán)蛋白β-catenin、驅(qū)動蛋白KIF11和KIF5C、血管抑素結(jié)合蛋白AMOT、肌動蛋白結(jié)合蛋白SVIL等。這些蛋白可通過復(fù)雜的相互作用促進細胞增殖，影響細胞遷移、管狀結(jié)構(gòu)的形成以及偽足的數(shù)量等，并進而影響血管生成。第二大蛋白質(zhì)類群是與線粒體功能活動關(guān)系密切的相

9、互作用蛋白，共32個，包括谷氨酰胺環(huán)化酶γGGCT、脫氧尿苷三磷酸酶DUT、腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶APRT、Ca2+的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族分子CAMK2D等。這些蛋白質(zhì)參與核酸和氨基酸代謝、RNA可變剪接等生物學(xué)過程。特別值得關(guān)注的是HBx不僅可與β脂肪酸氧化進程中的脂肪酰輔酶A合成酶ACSF2和脂肪羥酰輔酶A脫氫酶家族成員HADH等2個限速酶發(fā)生相互作用，而且還與酯酶分子甾醇載體蛋白SCP2、胰腺三酰甘油脂肪酶PNLIP和脂鈣蛋白

10、酶LCN1發(fā)生相互作用，從而干擾肝細胞脂代謝過程。這可能是HBV介導(dǎo)肝臟脂肪化和炎癥的主要原因。
　　在HBx轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)組研究中，我們共鑒定了4744個蛋白質(zhì)，其中從12MHBx、24M HBx組及其同窩小鼠中分別鑒定了3491、3464和3442、3298(FDR＜1％)個蛋白質(zhì)，四組樣品中共同鑒定的蛋白質(zhì)有2504個(FDR＜1％)。在定量研究方面，12MHBx和12M WT組定量分析的蛋白質(zhì)有2816個，定量數(shù)據(jù)的對

11、數(shù)值整體呈現(xiàn)正態(tài)分布，其SD值為0.20;24M HBx和24 M WT組定量分析的蛋白數(shù)目為2731個，定量數(shù)據(jù)整體分布的SD值為0.42。24M HBx組SD值與12M HBx組SD值相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明在HBx介導(dǎo)的從炎癥向癌癥發(fā)生的進程中，肝臟組織的異質(zhì)性在逐漸增加。以2.0倍差異作為生物學(xué)差異蛋白的篩選標準，我們在12M HBx組樣品中鑒定了22個差異表達蛋白，其中15個呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，7個呈現(xiàn)下調(diào)趨勢

12、;在24M HBx組發(fā)現(xiàn)97個差異表達蛋白，其中72個上調(diào)，25個下調(diào)。差異蛋白質(zhì)的GO分析顯示在12M HBx階段肌肉組織發(fā)育等功能顯著異常，這可能與肝臟星狀細胞活化引發(fā)細胞外基質(zhì)纖維化相關(guān);24M HBx結(jié)果顯示氧化還原、肌肉組織發(fā)育、轉(zhuǎn)錄活性、細胞骨架組成、糖代謝、脂代謝、小G蛋白信號途徑等生物學(xué)進程顯著富集。尤其是12M和24M HBx介導(dǎo)小鼠肝臟由炎癥向癌癥發(fā)展的過程中，我們分別鑒定了與CDC42信號途徑相關(guān)的3個和15個蛋白

13、質(zhì)表達上調(diào)，這提示CDC42信號途徑激活可能是HBx介導(dǎo)肝臟炎癥向癌癥發(fā)展的主要原因。在12MHBx炎癥組織中,雖然沒有發(fā)現(xiàn)線粒體功能紊亂的線索，但觀察到4個與脂代謝關(guān)系密切相關(guān)的蛋白如ADFP、DHTKD1、AKR1C18和CES2表達變化。當HBx介導(dǎo)肝臟由炎癥進入癌癥階段，18個線粒體功能相關(guān)蛋白如NDUFA5、LDHD、IVD和DHTKD1等表達變化顯著。線粒體是細胞脂肪代謝的主要場所之一，研究結(jié)果暗示脂肪代謝紊亂和線粒體功能失

14、調(diào)可能也是HBx引發(fā)肝臟炎癥進展到癌癥的主要原因。
　　將HBx相互作用蛋白質(zhì)組與定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)整合，我們發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)在HBx轉(zhuǎn)染累及的細胞骨架和線粒體功能方面具有很好的一致性。我們據(jù)此提出“HBx引發(fā)細胞骨架重塑和線粒體功能失調(diào)擾亂肝細胞脂代謝過程，誘發(fā)肝臟由炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化”的假設(shè)，并通過免疫組織化學(xué)和蛋白印跡實驗等進行了驗證，進一步說明了我們定量蛋白組學(xué)研究結(jié)論的正確性。
　　在此基礎(chǔ)上，我們從HBx誘發(fā)小鼠肝臟炎癥

15、和癌癥階段呈現(xiàn)相似差異的蛋白質(zhì)中篩選獲得了與細胞骨架和脂代謝關(guān)系密切的絲切蛋白(Cofilin-1，CFL1)和脂肪分化相關(guān)蛋白(Adipose differentiation-related protein，ADFP)作為肝病發(fā)生和發(fā)展的候選生物標志物分子進行了深入研究。利用免疫組織化學(xué)分析臨床HBV-HCC和非HBV-HCC肝癌組織樣本中的CFL1和ADFP的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)CFL1和ADFP在HBV-HCC肝癌組織中的表達水平明

16、顯高于非HBV-HCC，顯示了CFL1和ADFP具有作為生物標志物所必需的保守性和組織特異性。按照肝癌早期預(yù)警與診斷標志物應(yīng)具備特異性高、敏感、重現(xiàn)性好和患者依從性優(yōu)等要素，我們又進一步分析了HBV、HBV-HCC和HCV等患者的血清樣本中CFL1和ADFP的蛋白質(zhì)豐度，發(fā)現(xiàn)在HBV以及HBV-HCC患者血清中ADFP的豐度顯著升高，而CFL1在血清中未被檢測到。因此，ADFP可作為HBV誘發(fā)肝細胞癌早期預(yù)警及診斷的潛在標志物。

17、　　綜上所述，本研究依托實驗室的高覆蓋和高精度定量蛋白組學(xué)研究技術(shù)平臺，以HBx轉(zhuǎn)基因鼠為基因功能研究模型和SILAC小鼠作為蛋白組學(xué)定量內(nèi)標，深入系統(tǒng)地開展了HBx的功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究，揭示了HBx通過誘發(fā)細胞骨架重塑和干擾線粒體功能引起肝炎向肝癌發(fā)展的分子機制。在此基礎(chǔ)上，通過對大量臨床樣本的研究進一步證實ADFP可能是HBV誘發(fā)的肝細胞癌的早期預(yù)警及診斷標志物，不僅豐富了HBx的生物學(xué)功能及其引發(fā)肝病發(fā)生和發(fā)展的分子機制，也為HB