乙型肝炎病毒X蛋白通過(guò)上調(diào)Capn4表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的研究.pdf

1、背景:
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染與肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生發(fā)展之間具有十分密切的關(guān)系,其中乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)發(fā)揮著極其重要的作用。既往實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),HBx在誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中具有參與反式激活與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡與增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能。但HBx促進(jìn)

2、肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制依然尚未完全清楚。近期研究發(fā)現(xiàn),鈣蛋白酶小亞基(Calpain small subunit1,Capn4)在肝細(xì)胞癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)組織及轉(zhuǎn)移灶中為高表達(dá),提示Capn4在肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。因此,有必要進(jìn)一步研究HBx與Capn4之間的關(guān)系和相互作用機(jī)制。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)以人肝癌細(xì)胞系HepG2和H7402為研究對(duì)象,通過(guò)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV X基因,檢測(cè)HBx在肝癌

3、細(xì)胞中對(duì)Capn4表達(dá)的影響,觀察Capn4在HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用,探討HBx調(diào)節(jié)Capn4的分子機(jī)制,從而闡明HBx促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的新的分子機(jī)制,并為臨床治療HBV感染性肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、通過(guò)在HepG2和H7402細(xì)胞系中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV X基因,建立穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞系模型HepG2-X和H7402-X,并應(yīng)用報(bào)告基因、Real-time PCR和Western b

4、lot三種實(shí)驗(yàn)手段,分別檢測(cè)Capn4在HepG2(H7402)與HepG2-X(H7402-X)細(xì)胞系中的表達(dá)差異;同時(shí),應(yīng)用小RNA干擾(siRNA)技術(shù)沉默HBx在HepG2-X(H7402-X)中的表達(dá),觀察Capn4表達(dá)量的變化。
　　2、在HepG2和H7402細(xì)胞系中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV X基因,并通過(guò)報(bào)告基因、Real-time PCR和Western blot三種實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)Capn4表達(dá)量的變化。

5、
　　3、以人肝癌細(xì)胞系HepG2為模型,通過(guò)單層細(xì)胞傷痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Capn4在HBx促進(jìn)的肝癌細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用。
　　4、應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析Capn4的啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)其中存在核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的潛在結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用siRNA和特異性化學(xué)抑制劑,在HepG2-X和H7402-X細(xì)胞中對(duì)NF-κB進(jìn)行沉默和抑制,再應(yīng)用報(bào)告基因和Western blot兩種實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)細(xì)胞中C

6、apn4表達(dá)量的變化。以單堿基點(diǎn)突變技術(shù)將Capn4啟動(dòng)子序列中的潛在的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,并應(yīng)用報(bào)告基因檢測(cè)HBx對(duì)突變型Capn4啟動(dòng)子的激活情況。
　　結(jié)果:
　　1、在HepG2-X(H7402-X)細(xì)胞系中,Capn4的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均明顯高于其在HepG2(H7402)細(xì)胞系中的表達(dá)。同時(shí),針對(duì)HBx的siRNA可抑制Capn4的表達(dá)。
　　2、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV X基因24小時(shí)后,HepG2

7、和H7402細(xì)胞中的Capn4表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均有明顯上升。
　　3、穩(wěn)定表達(dá)HBx的人肝癌細(xì)胞HepG2-X的遷移能力明顯高于未表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞,而針對(duì)HBV X基因的siRNA可顯著降低HepG2-X的遷移能力。在HepG2-X細(xì)胞中應(yīng)用siRNA沉默Capn4的表達(dá)后, HepG2-X的遷移能力也顯著降低。
　　4、在HepG2-X和H7402-X細(xì)胞中,通過(guò)對(duì)NF-κB進(jìn)行沉默和抑制,Capn4的