鴨坦布蘇病毒的遺傳演化及毒力減弱的分子基礎(chǔ).pdf

1、自2010年鴨坦布蘇病毒首次在中國(guó)爆發(fā)以來(lái)，持續(xù)有鴨坦布蘇病毒病的相關(guān)報(bào)道。本文利用病毒分離、RT-PCR技術(shù)，在來(lái)自浙江、江蘇和安徽等省麻鴨病料中分離到13株鴨坦布蘇病毒，分別命名為ZJ201501、ZJ201502、ZJ201503、ZJ201504、ZJ201505、ZJ201506、ZJ201507、ZJ201508、JS201501、JS201502、AH201501、AH201502和AH201504。利用覆蓋DTMUV全基

2、因組的9對(duì)兩兩相互重疊的PCR引物，對(duì)13株病毒的全基因組進(jìn)行分段RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序、拼接，得到病毒的全基因組序列。運(yùn)用MegAlign和Mega7.0軟件，將這些毒株與之前實(shí)驗(yàn)室完成測(cè)序的15株分離株及從GenBank中按年份隨機(jī)選取的32株鴨坦布蘇病毒序列進(jìn)行比對(duì)，并繪制了ORF核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是基于ORF核苷酸序列還是E蛋白氨基酸序列繪制的進(jìn)化樹，2015年分離的毒株位于一個(gè)獨(dú)立的小分支上

3、，位于進(jìn)化樹的最上端，與GX2013G、GX2013C、CQW1和SD201120的遺傳距離較近，與早期分離的FX2010遺傳距離較遠(yuǎn);上述毒株的核苷酸同源性均大于96.7％，E蛋白氨基酸同源性均大于97.6％。表明DTMUV雖然發(fā)生了一定變異，但不同年代分離株的核苷酸和E蛋白的氨基酸仍然具有較高同源性。
　　為進(jìn)一步了解鴨坦布蘇病毒致病性的變化，根據(jù)進(jìn)化樹上的位置和病毒分離時(shí)間的不同，選取了5株病毒（SH201002、JS201

4、101、HB201214、ZJ201503和ZJ201502），通過(guò)鼻腔感染33周齡的產(chǎn)蛋麻鴨，每只接種103.5TCID50病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染組大部分鴨子均表現(xiàn)出食欲不振，剖檢發(fā)現(xiàn)最明顯的病理變化是脾臟腫大和卵巢出血。病毒分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)除SH201002外，其余分離株感染鴨的肺臟中均可分離到病毒，其它臟器中的病毒分離結(jié)果也略有不同，表明鴨坦布蘇病毒的組織嗜性可能發(fā)生了改變。JS201101接種鴨在感染后8日和12日各死亡1只，而其它病毒

5、感染鴨均沒(méi)有死亡;抗體檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)SH201002感染鴨的血清抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間比其余病毒感染鴨晚一些，表明坦布蘇病毒進(jìn)化過(guò)程中抗原性發(fā)生了改變。
　　為進(jìn)一步探究鴨坦布蘇病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性，將13株鴨坦布蘇病毒分離株分別經(jīng)鼻腔接種3周齡SPF BALB/c小鼠，每只感染104.0TCID50病毒。小鼠未表現(xiàn)出任何的臨床癥狀，小鼠的體重與PBS對(duì)照組比較未有明顯下降，只是在一定程度上抑制了小鼠的體重增長(zhǎng)，但是臟器分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)在部分分

6、離株感染小鼠的肺臟和鼻腔中可分離到病毒，說(shuō)明部分分離株已經(jīng)獲得了在小鼠體內(nèi)復(fù)制的能力。
　　為了深入闡明影響鴨坦布蘇病毒毒力的分子基礎(chǔ)，以本實(shí)驗(yàn)室致弱的FX2010-180P(180P)和其親本強(qiáng)毒FX2010為研究對(duì)象，利用反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，相互替換E基因，拯救基因重組病毒r180P-FX2010E和rFX2010-180PE（本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建）。將rFX2010、rFX2010-180PE、r180P和r180P-FX2010

7、E經(jīng)肌肉感染200μL1035TCID509周齡的雌麻鴨，第2天每組中放置3只未感染的SPF健康鴨作為接觸組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)rFX2010-180PE與親本強(qiáng)毒rFX2010相比，對(duì)鴨子表現(xiàn)全身性臟器感染，然而卻喪失了鴨通過(guò)接觸傳播的能力（與本實(shí)驗(yàn)室之前所做的結(jié)果吻合）;而r180P-FX2010E未能獲得強(qiáng)毒的特性，與親本毒r180P一樣，僅能在脾臟中低水平的復(fù)制，不能在鴨群中進(jìn)行水平傳播。
　　為了進(jìn)一步確定對(duì)鴨子水平傳播有關(guān)鍵影響

8、的氨基酸位點(diǎn)，在rFX2010的背景下，將E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的差異氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)突變，利用反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)分別拯救了3個(gè)區(qū)域突變毒株:rFX2010-EDⅠ、rFX2010-EDⅡ和rFX2010-EDⅢ，用相同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了麻鴨的致病性試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)rFX2010-EDⅠ和rFX2010-EDⅢ沒(méi)有改變強(qiáng)毒的致病性，不僅呈現(xiàn)全身性感染，而且可以通過(guò)接觸在鴨之間傳播;而rFX2010-EDⅡ僅能在脾臟中低水平復(fù)制，同時(shí)喪失了在

9、鴨之間傳播的能力。進(jìn)一步拯救位于EDⅡ中的2個(gè)氨基酸差異的單點(diǎn)突變毒株rFX2010-E/E89G和rFX2010-E/D120N。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rFX2010-E/E89G仍保持強(qiáng)毒的特性，可以通過(guò)接觸在鴨之間傳播;而rFX2010-E/D120N僅能在脾臟中低水平復(fù)制，喪失了在鴨之間傳播的能力，表現(xiàn)出與弱毒疫苗株180P相似的生物學(xué)特性。表明E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅱ中的120位氨基酸由D變?yōu)镹是導(dǎo)致坦布蘇病毒毒力減弱的關(guān)鍵氨基酸，突變?cè)撐稽c(diǎn)能