一株鴨坦布蘇病毒的全基因組測定及致病性研究.pdf

1、鴨坦布蘇病毒病自2010年初流行以來，已經(jīng)成為危害我國養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一。產(chǎn)蛋鴨發(fā)病后表現(xiàn)為持續(xù)性產(chǎn)蛋率低下，加之繼發(fā)感染，死淘率可達(dá)到15％-20%。本研究從山東某鴨養(yǎng)殖場無菌采集有疑似坦布蘇病毒（Tembusu virus， TMUV)感染癥狀的病鴨，開展了以下研究：根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)，通過病毒分離、鑒定的方法，獲得鴨坦布蘇病毒；通過設(shè)計(jì)相互覆蓋TMUV cDNA全長的引物，分段擴(kuò)增、測序、拼接獲得

2、了TMUV分離株全長基因組序列；通過對200日齡櫻桃谷產(chǎn)蛋鴨人工致病的動(dòng)態(tài)病理學(xué)觀察，證明病毒的主要靶器官為卵巢，明確了病毒感染產(chǎn)蛋鴨的卵巢病變產(chǎn)生時(shí)間、病變程度、以及與病毒載量的關(guān)系；
　　將采集的病料組織剪碎、研磨、離心、過濾除菌后，接種于9日齡健康鴨胚，收集尿囊液按照常規(guī)病毒分離方法進(jìn)行盲傳。該病毒在鴨胚傳代過程中，盲傳至3代以后，病毒液可導(dǎo)致鴨胚于3-4d內(nèi)死亡，并使鴨胚胚體水腫、出血，胚肝水腫、壞死。經(jīng)病毒理化性質(zhì)鑒定，

3、病毒的核酸類型為RNA，病毒為有囊膜病毒，不耐酸，對氯仿、乙醚等有機(jī)溶劑敏感，符合黃病毒成員的基本生物學(xué)特征。對收集的尿囊液經(jīng)RT-PCR檢測，其他幾種常見鴨源病原如鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV)、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV)、鴨乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus，DHBV)、鴨源禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV)檢測均為陰性。根

4、據(jù)TMUV-WR株NS3-NS4片段保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物通過RT-PCR方法擴(kuò)增出疑似目的條帶（300 bp)，經(jīng)測序、比對后發(fā)現(xiàn)，與已公布的黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒 IPDIA分離株核苷酸（GenBankNO:NC_018705)相似性為75.3%，與國內(nèi)己公布的TMUV分離株相比，同DK/TH/CU-1株(GenBankNO: KR061333.1)同源性最高，為95%，同 GX/1/12株（GenBankNO:KP71911

5、7.1)同源性最低，為91%。成功獲得一株源于山東地區(qū)的鴨坦布蘇病毒，命名為SDT1，為開展后續(xù)研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。
　　通過設(shè)計(jì)相互覆蓋TMUV cDNA全長的引物，分段擴(kuò)增、測序、拼接獲得了分離株全長基因組序列。全基因組序列分析結(jié)果表明，SDT1分離株全長10992 nt，含有一個(gè)開放閱讀框（ORF)，編碼一個(gè)長為2625 aa的多聚蛋白，預(yù)測的多聚蛋白切割位點(diǎn)與其他TMUV成員一致，共編碼10個(gè)功能蛋白。黃病毒代表成員以及坦布

6、蘇病毒分離株的進(jìn)化樹分析表明，SDT1分離株屬于黃病毒屬恩他耶家族成員，SDT1分離株與其他TMUV成員在全基因組核苷酸和氨基酸相似性分別為95%-98%，98.4%-99.6%。與國內(nèi)其他分離株相比，SDT1分離株同其他分離株的平均進(jìn)化距離（0.0299)高于其他毒株之間的平均進(jìn)化距離（0.0163)，本研究豐富了鴨坦布蘇病毒庫。
　　選取30只200日齡的產(chǎn)蛋櫻桃谷鴨進(jìn)行了回歸動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)之前，RT-PCR方法排除鴨坦布蘇病

7、毒自然感染，其中20只以0.5ml（TCID50）每只的劑量經(jīng)胸部肌肉接種鴨坦布蘇病毒作為攻毒組，10只通過注射等量PBS溶液分籠飼養(yǎng)作為陰性對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒感染后出現(xiàn)明顯的食欲下降、不愿走動(dòng)，精神萎靡、共濟(jì)失調(diào)，死亡時(shí)呈角弓反張等神經(jīng)癥狀。攻毒組均發(fā)病，發(fā)病率為100%；對照組無明顯臨床癥狀。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，能夠從感染鴨的血液、卵巢、肝臟、大腦組織中檢測到DTMUV。通過連續(xù)病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，卵巢病變最為顯著，卵泡充血、