坦布蘇病毒在種鴨中垂直傳播及其對(duì)種鴨的致病性研究.pdf

1、坦布蘇病毒感染(Tembusu virus infection)，是我國(guó)在2010年新出現(xiàn)的由坦布蘇病毒(Tembusu virus，TMUV)引起的一種傳染性疾病，該病主要引起產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋下降以及雛鴨出現(xiàn)頭頸震顫、四肢麻痹等神經(jīng)癥狀。目前該病在我國(guó)養(yǎng)鴨集中的地區(qū)均有發(fā)生，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失(Su，et al.2011)。TMUV屬于黃病毒科（Flaviviridae）、黃病毒屬（Flavivirus）、恩塔亞病毒群(Ntaya v

2、irus group)(Cao，et al.2011)。本試驗(yàn)就TMUV能否在種鴨中垂直傳播及TMUV對(duì)種鴨的致病性進(jìn)行研究，為該病的控制提供可靠的流行病學(xué)依據(jù)。
　　1、自然感染病例種鴨、種蛋、鴨胚、雛鴨中TMUV檢測(cè)
　　2013年，山東省聊城、泰安、廣饒地區(qū)共4個(gè)種鴨場(chǎng)相繼發(fā)生TMUV自然感染。收集發(fā)病鴨產(chǎn)的種蛋，共125枚。從中隨機(jī)抽取35枚種蛋，無(wú)菌收取卵黃膜樣品。將其余90枚種蛋（自然感染組）全部孵化，按照孵化場(chǎng)

3、中櫻桃谷種鴨蛋孵化要求設(shè)置孵化參數(shù)。同時(shí)，取20枚健康櫻桃谷種鴨蛋作為對(duì)照組進(jìn)行孵化。將不同來(lái)源的種蛋分開(kāi)孵化。每天照蛋一次，挑出未受精蛋和死亡鴨胚，及時(shí)無(wú)菌收取卵黃膜或胚腦、肝、脾等樣品。對(duì)出殼雛鴨在1日齡剖殺，取腦、肝、脾等組織。所有收取的樣品置于-80℃保存。通過(guò)尿囊腔途徑接種9日齡健康鴨胚進(jìn)行病毒分離，采用半套式RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)收獲的尿囊液進(jìn)行病毒檢測(cè)。結(jié)果顯示，自然感染組總受精率為82.22％(74/90)，總孵化率為6

4、2.16％(46/74);對(duì)照組的受精率和孵化率分別為95％(19/20)和84.21％(16/19)。在孵化過(guò)程中，28枚(31.1％)鴨胚死亡，剖檢可見(jiàn)胚腦充血、出血、水腫，心臟和肝臟出血。病毒檢測(cè)結(jié)果顯示，種蛋、死亡鴨胚和雛鴨中TMUV檢出率分別為51.43％(18/35)、60.71％(17/28)和10.87％(5/46)。此外，挑出的16枚未受精種蛋中有2枚檢測(cè)為TMUV陽(yáng)性(12.5％)?？傆?jì)，自然感染組的TMUV總檢出率

5、為33.6％(42/125)。對(duì)照組的種蛋、鴨胚和雛鴨檢測(cè)均為TMUV陰性。首次從死亡鴨胚中分離到一株TMUV，命名為TMUV-SDDE株，該分離株的ELD50為10-250/0.2 mL。用PCR擴(kuò)增TMUV-SDDE的E基因，測(cè)序。序列分析結(jié)果顯示，TMUV-SDDE與其他TMUV分離株的同源性高達(dá)96％-99.5％。經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，可以從攻毒雛鴨中重新分離到該病毒。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)TMUV可能經(jīng)種蛋發(fā)生垂直傳播。
　

6、　2、TMUV人工感染動(dòng)物模型的建立
　　基于上述試驗(yàn)結(jié)果，我們通過(guò)人工感染TMUV陰性的健康櫻桃谷種鴨建立動(dòng)物模型，進(jìn)行TMUV能否垂直傳播及TMUV對(duì)種鴨致病性的研究。將38周齡的櫻桃谷種鴨隨機(jī)分為A、B、C、D、E五組。A、B、C三組，每組15只母鴨、4只公鴨，公母鴨混群飼養(yǎng)。A組母鴨和B組公鴨靜脈接種TMUV-SDSG株(ELD50=10-2.37/0.2 mL)，2.5mL/只，A組公鴨和B組母鴨不接種病毒。C組作為對(duì)照

7、組，接種等量生理鹽水。D和E組各20只母鴨，D組靜脈接種2.5mL的TMUV-SDSG株，E組接種等量生理鹽水。各組隔離飼養(yǎng)。收集A、B、C三組種蛋，分別孵化，記錄種蛋受精和孵化情況。出殼后的1日齡雛鴨，隨機(jī)剖殺其中的一部分，取腦、肝、脾等。其余的雛鴨飼養(yǎng)于SPF隔離罩中，至15日齡剖殺，取腦、肝、脾等。收取飼養(yǎng)過(guò)程中死亡雛鴨的上述組織。對(duì)收集的各組織進(jìn)行處理后，接種鴨胚進(jìn)行病毒分離和半套式RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，A組種蛋的受精率和

8、孵化率分別82.2％(74/90)和62.2％(46/74)，B組種蛋的受精率和孵化率分別為78.0％(67/86)和65.7％(44/67)，而C組種蛋的受精率和孵化率分別為94％(94/100)和85.1％(80/94)。A組43枚和B組37枚鴨胚在孵化過(guò)程中死亡。剖檢可見(jiàn)，胚體出血、卵黃吸收不良、卵黃稀薄、肝臟或心臟出血。有的鴨胚頸部水腫、出血，腦水腫、充血。A組4只和B組7只弱雛死亡，剖檢可見(jiàn)腦水腫、或有出血點(diǎn)，卵黃吸收不良。病

9、毒檢測(cè)結(jié)果顯示，A組種蛋、死亡鴨胚、1日齡雛鴨、15日齡雛鴨和死亡弱雛中TMUV檢出率分別為60％，67.44％，35.48％，16.67％和100％。B組相應(yīng)的TMUV檢出率分別為50％，51.35％，46.88％，10％和71.43％。C組各樣品未檢測(cè)到TMUV。將陽(yáng)性擴(kuò)增片段進(jìn)行序列分析，結(jié)果與TMUV-SDSG株同源性在98.7％-100％。從種蛋、鴨胚到孵出的雛鴨均能檢測(cè)到TMUV，表明TMUV可以通過(guò)感染的種鴨經(jīng)鴨胚傳給下一

10、代，即TMUV可以在種鴨中發(fā)生垂直傳播。
　　3、TMUV對(duì)種鴨的致病性研究
　　D和E組，每組隨機(jī)標(biāo)記出10只，分別在1、4、7、10、13、16、19 dpi采血一次，采集泄殖腔棉拭子樣品一次，用間接ELISA方法檢測(cè)鴨血清中抗體水平，用細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IFN-γ和IL-4水平，用半套式RT-PCR檢測(cè)攻毒鴨排毒情況。每組另外10只，分別在3、7、11、15、19 dpi隨機(jī)剖殺兩只，無(wú)菌采集腦、肝臟、脾臟、卵泡膜

11、等組織，制作病理切片，用熒光定量PCR檢測(cè)各組織中TMUV載量。結(jié)果顯示，攻毒后，攻毒組種鴨產(chǎn)蛋下降（約由80％至60％），排白色稀便。攻毒組種鴨抗體水平從1dpi后開(kāi)始升高;至10dpi左右，達(dá)到最高水平;之后逐漸下降。IL-4和IFN-γ表達(dá)水平均在1dpi后開(kāi)始上升，分別在13dpi和16dpi達(dá)到高峰，之后開(kāi)始下降。對(duì)照組種鴨的抗體陰性，IFN-γ和IL-4表達(dá)水平無(wú)明顯變化。從4dpi開(kāi)始能夠檢測(cè)到排毒，一直持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(