鴨坦布蘇病毒E蛋白關(guān)鍵毒力位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)與鑒定.pdf

1、2010年于我國東南部沿海地區(qū)鴨養(yǎng)殖區(qū)爆發(fā)了抗原為鴨坦布蘇病毒的傳染性疾病，后來迅速流行于全國各地的主要鴨養(yǎng)殖區(qū)等(浙江、廣州、廣西、安徽、江蘇、山東、河北)。鴨群被感染后，癥狀表現(xiàn)產(chǎn)蛋下降、采食量降低、生長緩慢和典型的神經(jīng)癥狀，鴨群感染率為100％，死亡率高達(dá)10~30%，對(duì)我國的鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了安全隱患。鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV），屬于黃病毒科，黃病毒屬。黃病毒

2、屬包括乙型腦炎病毒（Janpanese encephalitis virus, JEV）、登革熱病毒（Dengue virus，DENV）、西尼羅病毒（West Nile virus）、黃熱病毒（yellow fever virus）等等。DTMUV基因是一條正鏈RNA，包含兩端的非編碼區(qū)（5’-UTR和3’UTR）和一個(gè)開放讀碼框，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白（C）、膜蛋白前體/膜蛋白（prM/M）和包膜糖蛋白（E），7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。目

3、前已經(jīng)從雞、鵝、鴿子、鳥和蚊子體內(nèi)分離出了此病毒，說明了DTMUV很可能已經(jīng)獲得了跨種傳播的能力。根據(jù)最新研究DTMUV在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上連續(xù)傳代、小鼠體內(nèi)正常復(fù)制尤其是肝、脾臟、腦等部位，小鼠臨床癥狀比較明顯，表現(xiàn)為黃病毒中典型的神經(jīng)癥狀。另外由于黃病毒為人畜工感染的重要病原，而 DTMUV也可通過蚊蟲傳播，所以其很可能是一種潛在的人類病原體，非常有必要做好 DTMUV的跨種傳播感染人預(yù)防工作，研究其致病性和開發(fā)新的疫苗。
　　本

4、研究是通過探尋DTMUV中關(guān)鍵毒力位點(diǎn)，來探究DTMUV的致病機(jī)制和減毒策略，給減毒活疫苗的研制提供新的減毒靶點(diǎn)，為 DTMUV的爆發(fā)流行和跨種傳播人做好預(yù)防工作
　　本研究主要包括四部分：
　　一、DTMUV病毒的毒力位點(diǎn)分析與鑒定
　　本實(shí)驗(yàn)通過小鼠顱內(nèi)連續(xù)傳代 DTMUV病毒，發(fā)現(xiàn)了病毒的蝕斑能力出現(xiàn)了減弱的生物學(xué)。通過蝕斑純化技術(shù)，分離出DTMUV-L與 DTMUV-S，發(fā)現(xiàn)DTMUV-S的蝕斑能力和神經(jīng)毒力有

5、明顯減弱的現(xiàn)象。通過核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，突變病毒的在E388位有一個(gè)絲氨酸（S）到精氨酸（R）的突變，其他核苷酸的突變位于非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS5中。根據(jù)有關(guān)研究證明，黃病毒屬中的E蛋白是病毒關(guān)鍵的毒力部位，在病毒感染過程中具有細(xì)胞吸附、膜融合等重要作用，包含多種抗原表位，是中和抗體結(jié)合的區(qū)域，所以確定了E蛋白388位突變位點(diǎn)的研究路線。
　　二、突變感染性克隆pS388R的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)室已將DTMUV的結(jié)構(gòu)基因prM和

6、E基因嵌合在乙腦病毒的感染性克隆載體上E70上，構(gòu)建了嵌合感染性克隆pCJDTMUV。為探究該E388突變是否對(duì)鴨坦布蘇病毒的生物學(xué)特征有影響，在感染性克隆質(zhì)粒 pCJDTMUV基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)，將E388位氨基酸由S突變?yōu)镽，構(gòu)建了攜帶突變位點(diǎn)的感染性克隆質(zhì)粒pS388R，并成功拯救獲得攜帶該突變的恢復(fù)病毒rS388R。
　　三、恢復(fù)病毒rS388R與親本病毒rWT株病毒的體外病毒特征對(duì)比
　　本研究評(píng)價(jià)了

7、恢復(fù)病毒rS388R體外水平的生物學(xué)特征。生長曲線上BHK-21、C6/36和SY-SH5Y細(xì)胞上沒有明顯的差異，但是在Vero，DF-1細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)rS388R的生長曲線明顯減弱；蝕斑形態(tài)上看rS388R病毒的蝕斑明顯減小；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明兩株病毒在表達(dá)自身結(jié)構(gòu)蛋白上沒有明顯差異；溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rS388R對(duì)溫度的變化更加敏感，病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變?nèi)?；病毒的吸附?shí)驗(yàn)表明兩株病毒沒有明顯的差異，但肝素受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)攜帶S388

8、R突變的病毒是依賴于結(jié)合宿主細(xì)胞中的硫酸乙酰肝素（HS）受體來完成病毒感染過程。
　　四、恢復(fù)病毒rS388R與親本病毒rWT的動(dòng)物水平的評(píng)價(jià)
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明rS388R病毒株的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力都明顯弱于rWT親本株，能夠有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體和中和抗體，而且具有良好的免疫保護(hù)結(jié)果。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)并探究了鴨坦布蘇病毒E388突變對(duì)病毒生物學(xué)特征和致病機(jī)制的影響，構(gòu)建了攜帶突變位點(diǎn)的感染性克隆，