鴨坦布蘇病毒病安徽株AH-F10的分離鑒定及防控技術(shù)研究.pdf

1、2009年以來，安徽省及周邊省市規(guī)模鴨場(chǎng)流行以種鴨和蛋鴨產(chǎn)蛋驟降并伴發(fā)死亡的疾病，疫情傳播速度快，波及面廣，對(duì)規(guī)?；N鴨場(chǎng)、蛋鴨場(chǎng)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，安徽省宣城、安慶、池州、銅陵、巢湖、合肥、淮南、六安等主要養(yǎng)鴨地區(qū)疫情尤為嚴(yán)重。疫情發(fā)生時(shí)，鴨群的采食量迅速下降，隨后產(chǎn)蛋率急劇下降、甚至停產(chǎn)并出現(xiàn)不同程度死亡。不同地區(qū)、不同品種的種鴨和蛋鴨群發(fā)病率20％～30％，鴨群群內(nèi)發(fā)病率高達(dá)100％，病死率約為5％～10％。后備種鴨和蛋鴨發(fā)病導(dǎo)致開

2、產(chǎn)推遲，產(chǎn)蛋率低;產(chǎn)蛋期鴨群在經(jīng)過3～5周的產(chǎn)蛋下降后，產(chǎn)蛋恢復(fù)過程非常緩慢，難以達(dá)到高峰。本研究從2010年起，深入疫區(qū)規(guī)模鴨場(chǎng)廣泛收集流行病學(xué)數(shù)據(jù)，采集臨床病鴨組織和血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，證明該病原是鴨坦布蘇病毒(Duck tembusu virus，DTMUV)是一種新發(fā)減蛋-死亡綜合征的鴨傳染病。本文在流行病學(xué)調(diào)查、臨床學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)研究的基礎(chǔ)上，利用分離鑒定的DTMUV安徽分離株AH-F1O建立了DTMUV的分子生物學(xué)診斷方法

3、和抗原抗體瓊擴(kuò)試驗(yàn)，研制了滅活疫苗和高免卵黃抗體，初步建立了安徽規(guī)模鴨場(chǎng)鴨坦布蘇病毒病防治技術(shù)，并在部分規(guī)模鴨場(chǎng)中試應(yīng)用，有效地控制了安徽減蛋-死亡綜合征（鴨坦布蘇病毒?。┞雍土餍小?br>　　1、規(guī)模鴨場(chǎng)鴨坦布蘇病毒病流行病學(xué)調(diào)查為全面了解我省規(guī)模鴨場(chǎng)鴨坦布蘇病毒流行情況，對(duì)全省9個(gè)市、24個(gè)縣的74個(gè)規(guī)模鴨場(chǎng)（戶）的蛋鴨減蛋-死亡綜合征發(fā)病情況進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查、臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷。結(jié)果表明，安徽省規(guī)模鴨場(chǎng)（戶）的蛋鴨減蛋-死亡綜合

4、征的主要病原為鴨坦布蘇病毒(DTMUV)，群體總發(fā)病率10.5％，病死率7.24％，產(chǎn)蛋率下降42.5％。用PCR方法對(duì)收集的527份病料檢測(cè)，結(jié)果鴨坦布蘇病毒核酸陽性504份，陽性檢出率95.6％。分析結(jié)果表明，DTMUV感染、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件差和環(huán)境氣候多變等是蛋鴨減蛋-死亡綜合征多發(fā)的重要誘因。
　　2、鴨坦布蘇病毒安徽AH-F10株的分離鑒定本試驗(yàn)從安徽規(guī)模鴨場(chǎng)臨床表現(xiàn)為產(chǎn)蛋突然降低的鴨群，無菌采集肝、脾、胰腺、卵泡、輸卵管、

5、卵巢、血液、淋巴結(jié)、和腎臟等病料，分別接種10日齡SPF雞胚進(jìn)行病原分離，經(jīng)SPF傳代、PCR鑒定和基因序列分析等鑒定，結(jié)果獲得1株DTMUV。對(duì)分離到的病毒命名為安徽AH-F10，致病性試驗(yàn)和特性檢測(cè)結(jié)果表明，該株病毒對(duì)雞胚的半數(shù)致死量(ELD50)為10-267/0.2mL，鴨胚的半數(shù)致死量(ELD50)為103.05/0.2mL，該病毒在pH7.2的條件下不能凝集鴨、雞的紅細(xì)胞，不能在雞胚成纖維細(xì)胞生長，但能在鴨胚成纖維細(xì)胞生長。

6、RT-PCR擴(kuò)增和序列分析結(jié)果證明，該病毒與中國各地引起鴨產(chǎn)蛋下降綜合征的新型鴨坦布蘇病毒的同源性達(dá)到96-99％。
　　3、安徽AH-F1O株DTMUV的致病性研究為進(jìn)一步弄清DTMUV的致病性，本研究對(duì)安徽分離株AH-F10進(jìn)行動(dòng)物致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明，用每只103.05個(gè)ELD50的AH-F10病毒頸部肌肉注射28周齡高產(chǎn)蛋鴨，鴨呈現(xiàn)采食量下降，隨后產(chǎn)蛋量下降并逐漸停止，而未攻毒對(duì)照組鴨表現(xiàn)正常。病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攻毒鴨可見明顯

7、的卵巢變性、變形和萎縮，而對(duì)照組鴨表現(xiàn)正常，剖檢無明顯病變。用同樣劑量攻擊雛鴨，結(jié)果雛鴨出現(xiàn)精神不振，蜷縮，流涎，減食，糞便稀薄，呈綠色水樣便，嚴(yán)重的雙腿向后伸張，站立不起，解剖見腦膜出血，肝臟出血腫大，胰腺有出血，腸道腫大。這些結(jié)果表明，本研究分離到的DTMUV安徽分離株AH-F10不僅對(duì)產(chǎn)蛋鴨致病，而且對(duì)雛鴨有明顯的致病作用，并能夠引起雛鴨死亡。
　　4、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)鴨坦布蘇病毒及抗體方法的建立本研究用濃縮DTMUV安徽A

8、H-F10株抗原免疫新西蘭大白兔，制備抗鴨坦布蘇病毒高免血清，以濃縮的病毒與抗鴨坦布蘇病毒血清抗體進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。結(jié)果表明，以1/15M pH7.2 PBS配制的含0.85％瓊脂糖凝膠進(jìn)行瓊擴(kuò)試驗(yàn)，抗原抗體反應(yīng)效果最好。用鴨坦布蘇病毒AH-F10株提純抗原和兔抗AH-F10抗體效價(jià)均能達(dá)到1∶32。用該血清瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)感染鴨心、脾、腎、卵巢、卵泡、淋巴結(jié)，結(jié)果陽性檢出率為83.9％，分離病毒尿囊液陽性檢出率為100％。兔抗AH-F10

9、血清不與GPV、DPV、NDV、IBDV、EDSV發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法可應(yīng)用于臨床感染鴨群、免疫鴨群DTMUV及抗體的監(jiān)測(cè)，是一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、易于判斷、實(shí)用性強(qiáng)的診斷方法，適合在臨床推廣應(yīng)用。
　　5、雞抗鴨坦布蘇病毒卵黃抗體的制備和臨床應(yīng)用為探索高免卵黃抗體對(duì)鴨坦布蘇病毒病的防治效果，本研究以鴨坦布蘇病毒AH-F10株制備的滅活免疫制劑免疫健康高產(chǎn)蛋雞，應(yīng)用瓊擴(kuò)方法檢測(cè)卵黃抗體效價(jià)，收集高效價(jià)卵黃抗體，采用氯仿抽提和硫酸

10、銨鹽析法純化卵黃抗體，結(jié)果表明，免疫雞抗坦布蘇病毒卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶32以上，該抗體能中和雞胚尿囊液中的坦布蘇病毒;臨床應(yīng)用結(jié)果顯示，制備的抗鴨坦布蘇病毒卵黃抗體對(duì)未發(fā)病鴨預(yù)防保護(hù)率達(dá)95％以上，發(fā)病鴨群治療保護(hù)率達(dá)90％以上，表明高免卵黃抗體對(duì)防控鴨坦布蘇病毒病具有顯著的效果。
　　6、鴨坦布蘇病毒滅活油乳免疫制劑的研制和初步應(yīng)用本研究將鴨坦布蘇病毒AH-F10株接種SPF雞胚，并測(cè)定病毒的毒力和滴度，結(jié)果該病毒的基礎(chǔ)種子批

11、病毒液ELD50為10-2.67 ELD50/0.2mL、EID50為103.05EID50/0.2mL、TCID50為1055 TCID50/0.2mL、病毒的瓊擴(kuò)滴度為1∶128;生產(chǎn)種子批病毒液ELD50為10-2.55ELD50/0.2mL、EID50為103.09EID50/0.2mL、TCID50為105.9 TCID50/0.2mL、病毒滴度為1∶128。以甲醛和β-丙內(nèi)酯(BLP)分別滅活病毒，結(jié)果表明，0.3％甲醛或0

12、.05％BPL即可以獲得最佳滅活效果。使用水相、油相包埋乳化技術(shù)，選用不同的水相、油相比例，用ATS機(jī)器乳化，通過調(diào)整油苗佐劑成分最佳配比，最后確認(rèn)HLB7.0，乳化劑含量10％，油水比為5∶1的比例能提供最佳穩(wěn)定性及免疫效果、通過劑型檢驗(yàn)、穩(wěn)定檢測(cè)、粘度測(cè)定、無菌檢驗(yàn)、安全性檢測(cè)及保存期檢測(cè)均達(dá)到成品疫苗所需要求，最小免疫劑量為0.25mL。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫后第2周可以測(cè)到特異抗體;第4周免疫組的抗體水平達(dá)到最高峰1∶64，隨后

13、抗體水平緩慢下降并保持在一定水平，第八周仍維持在1∶32。攻毒試驗(yàn)表明，免疫攻毒鴨的排毒及發(fā)病率判定，本疫苗對(duì)免疫組鴨的保護(hù)率為95％以上?？贵w水平在1∶32時(shí)，達(dá)到完全抵抗病毒的攻擊。田間動(dòng)物試驗(yàn)表明該疫苗在免疫抗AH-F10病毒抗體水平可達(dá)1∶32，達(dá)到預(yù)期免疫抗體水平，且在免疫后5個(gè)月內(nèi)保持1∶32的高效價(jià)抗體，而在免疫后5個(gè)月抗體水平出現(xiàn)下降，到免疫后6個(gè)月時(shí)保持抗體水平在1∶16，該疫苗對(duì)于免疫蛋鴨使用安全有效。通過田間試驗(yàn)和