黃連素對(duì)LPS刺激的GMC NF-κB激活及其下游炎癥因子表達(dá)的影響.pdf

1、黃連素(Berberine，[C20H18NO4]，又稱(chēng)小檗堿)是從毛莨科植物黃連(Coptidis rhizoma，CR)、黃柏(Cortex phellodendri)根莖中提取出的一種異喹啉類(lèi)生物堿。既往研究證實(shí)：黃連素具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、抗炎、抗氧化、抑制醛糖還原酶等藥理作用，顯示黃連素作為防治DM及其并發(fā)癥用藥具有一定的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。本文的前期研究發(fā)現(xiàn)黃連素能明顯改善DM腎損傷模型動(dòng)物的腎功能，抑制腎

2、臟肥大、減少蛋白尿；體外實(shí)驗(yàn)研究表明黃連素可以抑制高糖培養(yǎng)的大鼠GMC增殖和ECM積聚，然其分子作用機(jī)理尚不十分清楚。鑒于NF-κB的激活及下游炎癥因子的表達(dá)在DN的病理發(fā)展過(guò)程中起十分重要作用，黃連素是否能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路及其下游炎癥因子的表達(dá)以減輕腎臟炎性反應(yīng)、改善ECM積聚、發(fā)揮抗DN的綜合效應(yīng)?值得探討、研究。
　　 本文前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，黃連素對(duì)實(shí)驗(yàn)性DN模型具有較好的腎功能保護(hù)作用。研究中發(fā)現(xiàn)，黃連素可

3、以減少DN模型腎組織中IκB-α的降解和腎小球細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的陽(yáng)性表達(dá)，下調(diào)ICAM-1，TGF-β1和ECM成分FN的表達(dá)。提示DN模型中腎組織NF-κB信號(hào)通路被激活，黃連素抗DN作用可能與其抑制NF-κB炎癥信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。然在整體動(dòng)物模型上，這種作用不排除黃連素降糖作用的間接效應(yīng)，需進(jìn)一步明確黃連素不依賴(lài)其降糖效應(yīng)、相對(duì)特異性的抑制腎固有細(xì)胞NF-κB激活而發(fā)揮抗DN效應(yīng)的機(jī)制。因此本研究中采用炎性刺激脂多糖

4、(Lipopolysaccharide，LPS)刺激的而非高糖培養(yǎng)的大鼠GMC作為研究對(duì)象，觀察黃連素對(duì)其N(xiāo)F-κB信號(hào)通路及其下游炎癥因子ICAM-1、iNOS的影響。
　　 目的：
　　 1.觀察黃連素對(duì)LPS刺激的大鼠GMC增殖及ECM的主要成分---FN蛋白表達(dá)的影響。
　　 2.觀察黃連素對(duì)LPS刺激的大鼠GMC NF-κB炎性信號(hào)通路及其下游炎癥因子ICAM-1、iNOS蛋白表達(dá)的影響，以深入研究黃連

5、素抗DN炎性損傷的分子機(jī)制。
　　 方法：本課題組自行分離、培養(yǎng)、鑒定、穩(wěn)定傳代的SD大鼠GMC，常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，飽和濕度，5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天用含0.25％的胰酶消化傳代。
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組1)正常對(duì)照組(NG)2)細(xì)胞炎癥模型組(100 ng/ml LPS，LPS)3)黃連素低劑量(10 μM BBR+100 ng/ml LPS，BL)4)黃連素中劑量(3

6、0 μM BBR+100 ng/ml LPS，BM)5)黃連素高劑量(90 μM BBR+100 ng/ml LPS，BH)6)NF-κB抑制劑組(100 μM PDTC+100 ng/ml LPS，PDTC)實(shí)驗(yàn)用超純水作為溶媒溶解黃連素，用PBS作為溶媒溶解PDTC。
　　 2.MTT比色法檢測(cè)黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS處理24 h大鼠GMC細(xì)胞活力的影響。
　　 3.Western Blot檢測(cè)黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS處理3

7、0 min，12h和24h大鼠GMCNF-κB p65、IκB-α，ICAM-1、iNOS和FN蛋白表達(dá)的影響。
　　 4.免疫熒光染色、激光共聚焦觀察黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS處理30 min大鼠GMCNF-κB p65核轉(zhuǎn)位的影響。
　　 5.亞硝酸酶法試劑盒檢測(cè)黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS處理24 h大鼠GMC細(xì)胞培養(yǎng)液中NO代謝產(chǎn)物NO2-+NO3-的含量變化來(lái)反映GMC NO的分泌情況。
　　 結(jié)果:
　　

8、1.黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC細(xì)胞活力的影響。MTT法觀察細(xì)胞活力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)終濃度為100 ng/ml的LPS處理24 h可以明顯促進(jìn)大鼠GMC增殖(P＜0.05)；黃連素預(yù)干預(yù)12 h后與LPS同處理24h能夠劑量依賴(lài)性的抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠GMC增殖(P＜0.05)；其中90μM的劑量達(dá)到較理想的抑制效應(yīng)，最后選擇10，30，90μM三個(gè)劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；而用黃連素對(duì)未加LPS刺激的大鼠GMC進(jìn)行干預(yù)36 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1

9、0-90μM的黃連素對(duì)正常培養(yǎng)的大鼠GMC的細(xì)胞活力沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明本文選的三個(gè)劑量對(duì)細(xì)胞是沒(méi)有毒性的；100 μM的NF-κB特異性抑制劑PDTC能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠GMC增殖(P＜0.05)。
　　 2.黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC FN蛋白表達(dá)的影響。LPS可顯著誘導(dǎo)腎小球系膜FN的蛋白表達(dá)上調(diào)，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMCFN蛋白表

10、達(dá)增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導(dǎo)的GMC FN蛋白表達(dá)的作用。
　　 3.黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC NF-κB激活的影響。
　　 3.1 Western Blot結(jié)果顯示：LPS刺激30 min可明顯誘導(dǎo)GMC細(xì)胞核中NF-κBp65的蛋白表達(dá)增加、細(xì)胞漿中NF-κB p65的蛋白表達(dá)減少，與正

11、常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組與模型組相比，胞核中NF-κB p65的蛋白表達(dá)減少、胞漿中NF-κB p65蛋白表達(dá)增加，以黃連素中、高劑量組及PDTC組作用顯著，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制細(xì)胞漿中NF-κB p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的作用，并呈一定的量效依賴(lài)關(guān)系。
　　 3.2 IκB-α是NF-κB的抑制性蛋白，胞漿中IκB-α的磷酸化降解可促

12、進(jìn)NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。LPS刺激30 min即可引起GMC胞漿中IκB-α蛋白的降解，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC胞漿IκB-α蛋白的降解具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用顯著，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與胞漿/胞核p65的蛋白表達(dá)結(jié)果相吻合，提示黃連素通過(guò)抑制IκB-α的降解、減少p65的轉(zhuǎn)位入核，從

13、而抑制NF-κB的激活。
　　 3.3 免疫熒光染色，激光共聚焦定位觀察可見(jiàn)：正常對(duì)照組細(xì)胞核未見(jiàn)NF-κB p65的熒光染色；經(jīng)LPS刺激30 min后，LPS刺激組細(xì)胞核密布NF-κB p65的熒光染色；黃連素預(yù)干預(yù)組細(xì)胞核散在NF-κB p65熒光染色;PDTC組細(xì)胞核極少見(jiàn)NF-κB p65的熒光染色。免疫熒光染色，激光共聚焦觀察佐證了黃連素具有抑制LPS刺激的GMC NF-κB p65核轉(zhuǎn)位的作用。
　　 4.

14、黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC炎癥因子表達(dá)的影響。
　　 4.1 黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC ICAM-1蛋白表達(dá)的影響LPS干預(yù)12 h即可顯著誘導(dǎo)GMC ICAM-1的蛋白表達(dá)上調(diào)，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC ICAM-1蛋白表達(dá)增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

15、.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導(dǎo)的GMC的炎癥粘附分子ICAM-1蛋白表達(dá)的作用。
　　 4.2 黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC iNOS蛋白表達(dá)的影響正常狀態(tài)下，GMC幾乎不表達(dá)iNOS蛋白，LPS干預(yù)12 h即可顯著誘導(dǎo)GMC iNOS的蛋白表達(dá)上調(diào)，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMC iNOS蛋白表達(dá)具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和P

16、DTC組抑制作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示黃連素具有抑制LPS誘導(dǎo)的GMC炎性酶iNOS蛋白表達(dá)的作用。
　　 5.黃連素預(yù)干預(yù)對(duì)LPS刺激的大鼠GMC NO生成的影響。一氧化氮的半衰期極短，無(wú)法直接檢測(cè)NO的生成量，因此檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO代謝產(chǎn)物NO2-+NO3-的含量變化來(lái)反映NO的變化情況。LPS處理24 h可引起細(xì)胞培養(yǎng)液中NO2-+NO3-含量顯著升高，與正常對(duì)照組比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

17、義(P＜0.05)；黃連素各劑量預(yù)干預(yù)組、PDTC組對(duì)LPS誘導(dǎo)的GMCNO分泌增加具有一定的抑制作用，尤以黃連素中、高劑量組和PDTC組抑制作用明顯，與LPS組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示黃連素在抑制LPS誘導(dǎo)的GMC炎性酶iNOS蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，具有明顯抑制NO生成增加的作用。
　　 結(jié)論：LPS能顯著誘導(dǎo)大鼠GMC增殖與FN蛋白高表達(dá)，激活大鼠GMC NF-κB信號(hào)通路及其下游炎性黏附因子ICAM-1、炎