益生菌對LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和炎癥因子表達(dá)的影響作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖(LPS)能直接激活哺乳動物的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，這些炎癥介質(zhì)能直接或間接地對細(xì)胞和組織產(chǎn)生損傷作用。在慢性肝病病人和一些肝病動物模型中，腸道菌群紊亂和屏障功能失調(diào)的情況普遍存在，由此導(dǎo)致腸道來源的LPS移位進(jìn)入肝臟，進(jìn)一步惡化肝臟功能。益生菌是一類能對機體產(chǎn)生有益作用的細(xì)菌。在一些與LPS相關(guān)、并存在腸道屏障功能失調(diào)的肝病模型中（如酒精或D-半乳糖

2、胺誘導(dǎo)的肝病模型），益生菌被報道能抑制肝損傷和炎癥反應(yīng)。益生菌在這些模型中的有益作用依賴兩點:首先，必須在肝病模型構(gòu)造前用合適劑量的益生菌處理適當(dāng)?shù)臅r間;其次，在大多數(shù)情況下，它們的作用機制被推測是通過降低腸道屏障通透性、從而減少腸道來源LPS移位至肝臟而間接實現(xiàn)的。從另一個角度看，益生菌不僅能直接調(diào)節(jié)健康人或者實驗動物的腸道免疫功能，還有可能對肝臟的免疫功能產(chǎn)生影響作用。如腸腔內(nèi)細(xì)菌合成的、具有抗炎癥作用的短鏈脂肪酸，能通過門靜脈進(jìn)入

3、肝臟;另外，已有的研究表明，腸腔內(nèi)共生菌能影響肝臟樹突狀細(xì)胞的免疫功能。鑒于此，我們提出，益生菌在LPS相關(guān)的肝病模型中的預(yù)防機制，除了保護腸道屏障功能外，是否還有其它機制？如用益生菌預(yù)先處理實驗動物后，是否能影響肝臟的免疫功能從而使得肝臟能直接對抗LPS誘導(dǎo)的損傷或炎癥反應(yīng)？為此，我們希望構(gòu)建一個LPS誘導(dǎo)的動物肝損傷模型:它不同于酒精或D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷模型，即不存在腸道屏障通透性的改變及細(xì)菌移位至肝臟，從而盡可能地排除腸道來

4、源的LPS及其它細(xì)菌成分對肝臟病理進(jìn)程的干擾。如果可能，我們用該模型來進(jìn)一步研究篩選出的益生菌預(yù)先處理動物后，對肝臟損傷和炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。
　　方法：
　　構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型:用不同劑量LPS（IP;單次處理）處理C57/BL6小鼠后，檢測腸道屏障通透性的變化情況和細(xì)菌移位至肝臟的情況。為了進(jìn)一步研究腸道內(nèi)源性共生菌對LPS誘導(dǎo)的肝損傷的影響，我們比較分析未清腸小鼠和用廣譜抗生素清腸的小鼠在LPS誘導(dǎo)的血清丙氨酸

5、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及肝臟TNF-α表達(dá)水平上的差異。
　　如果某個劑量的LPS處理后，腸道屏障通透性的無顯著變化，腸道共生菌也沒有顯著影響LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α表達(dá)水平，則進(jìn)一步研究益生菌菌株預(yù)先處理對該劑量的LPS誘導(dǎo)的肝損傷的干預(yù)作用。用不同劑量的Lactobacillusfermentum ZYL0401(LF41)、 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)、 Bifidobacterium

6、catenulatum ZYB0401(BC41)（這些菌株懸于500μl PBS中）、或500μl PBS處理（IG;每天一次）小鼠不同天數(shù)，接著用LPS處理，并檢測LPS處理后的肝損傷和炎癥因子表達(dá)情況（如檢測血清ALT水平、分析肝臟組織學(xué)變化、檢測肝臟及血清TNF-α表達(dá)水平等）。
　　益生菌的作用機制研究:對LPS誘導(dǎo)的肝損傷有顯著抑制作用的益生菌菌株，進(jìn)一步探索其作用機制。1）評估細(xì)菌的作用:如確定益生菌預(yù)先處理后小鼠盲

7、腸和糞便短鏈脂肪酸的水平、腸道通透性是否改變、腸道內(nèi)源性共生菌是否影響菌株處理后肝臟對LPS的拮抗作用、以及菌株在體外是否能直接抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)等。2）分析益生菌菌株處理后機體免疫功能的變化及作用:首先確定菌株菌種16S rRNA在不同腸段組織的水平，從而篩選出濃度最高的“靶向腸段”;其次，結(jié)合已經(jīng)獲得的一些實驗數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)參考，篩選出需檢測的免疫相關(guān)的介質(zhì)及確定它們在“靶向腸段”的基因或蛋白表達(dá)情況;如果出現(xiàn)表達(dá)顯

8、著改變的介質(zhì)，則進(jìn)一步分析其在肝臟的表達(dá)情況，并研究它們與菌株處理后肝臟獲得的拮抗LPS的損傷作用是否相關(guān)。
　　結(jié)果：
　　用低劑量LPS處理小鼠(0.5mg/kg BW)后，血清ALT和肝臟TNF-α mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)。相比未清腸對照處理，抗生素清腸并無顯著影響LPS誘導(dǎo)的二者的水平。另外，該模型中也不存在腸道屏障通透性的顯著變化和細(xì)菌移位至肝臟。
　　高劑量LF41(H-LF41)處理小鼠10天顯著抑制

9、LPS誘導(dǎo)的血清ALT水平、肝臟及血清TNF-α mRNA和蛋白的表達(dá)水平、以及肝臟炎癥細(xì)胞的浸潤。而滅活的高劑量LF41、低劑量LF41(L-LF41)、高劑量LGG、和高劑量BC41均對LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α mRNA水平無顯著作用。另外，H-LF41處理小鼠21天對LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α mRNA水平無顯著影響。
　　用H-LF41處理小鼠10天后:回腸前列腺素E2(PGE2)的分泌和肝臟PGE2的含

10、量均顯著增加;回腸上皮細(xì)胞環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá)顯著上調(diào)，而肝臟COX-2和COX-1的表達(dá)均無顯著變化。H-LF41處理10天上調(diào)回腸黏膜固有層細(xì)胞IL-10的表達(dá)水平而對肝臟IL-10水平無顯著作用，但擴增了LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10的水平。外源給予的PGE2處理亦顯著擴增LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10水平。H-LF4聯(lián)合EP-4受體抑制劑處理10天后，H-LF41介導(dǎo)的對LPS誘導(dǎo)的肝臟TNF-α mRNA水平的抑制作用消失

11、了;同樣地，PGE2處理亦顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟TNF-αmRNA水平。H-LF4聯(lián)合IL-10中和抗體處理10天終結(jié)了H-LF41介導(dǎo)的對ALT水平的抑制作用。PGE2處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ALT表達(dá)。H-LF4聯(lián)合COX-2抑制劑處理10天，不僅終結(jié)H-LF41介導(dǎo)的對回腸和肝臟PGE2表達(dá)的上調(diào)作用，而且還消除了其對LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10水平的擴增作用。相比H-LF41單獨處理10天，H-LF41聯(lián)合COX-2抑制劑處理1

12、0天顯著促進(jìn)肝臟單個核細(xì)胞和回腸組織TNF-α的表達(dá)，并且顯著增高由TNF-α介導(dǎo)的腸道上皮細(xì)胞通透性。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)現(xiàn)在低劑量LPS誘導(dǎo)的肝炎模型中，腸道來源的細(xì)菌成分對肝損傷與炎癥因子的表達(dá)所起的作用可能很小。H-LF41預(yù)先處理10天能顯著拮抗LPS對肝臟的損傷作用及對TNF-α表達(dá)的促進(jìn)作用。H-LF41處理10天影響了小鼠的固有免疫:即上調(diào)了肝臟PGE2水平，但不伴隨肝臟COX-2和COX-1表達(dá)的增強;

13、促進(jìn)了回腸PGE2分泌，且伴隨回腸COX-2表達(dá)的上調(diào)。此外，H-LF41處理10天擴增了LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10表達(dá)。重要的是，H-LF41處理誘導(dǎo)的PGE2和IL-10賦予了肝臟拮抗LPS誘導(dǎo)的肝損傷和炎癥因子表達(dá)的能力。H-LF41介導(dǎo)的對肝臟PGE2和IL-10水平的上調(diào)作用都受COX-2的控制。COX-2在H-LF41處理10天的小鼠還作為一個預(yù)防機制:即阻止了回腸和肝臟細(xì)胞TNF-α表達(dá)的上調(diào)及由TNF-α介導(dǎo)的腸道通透性