益生菌對LPS誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和炎癥因子表達的影響作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的脂多糖(LPS)能直接激活哺乳動物的單核巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，這些炎癥介質(zhì)能直接或間接地對細胞和組織產(chǎn)生損傷作用。在慢性肝病病人和一些肝病動物模型中，腸道菌群紊亂和屏障功能失調(diào)的情況普遍存在，由此導(dǎo)致腸道來源的LPS移位進入肝臟，進一步惡化肝臟功能。益生菌是一類能對機體產(chǎn)生有益作用的細菌。在一些與LPS相關(guān)、并存在腸道屏障功能失調(diào)的肝病模型中（如酒精或D-半乳糖

2、胺誘導(dǎo)的肝病模型），益生菌被報道能抑制肝損傷和炎癥反應(yīng)。益生菌在這些模型中的有益作用依賴兩點:首先，必須在肝病模型構(gòu)造前用合適劑量的益生菌處理適當(dāng)?shù)臅r間;其次，在大多數(shù)情況下，它們的作用機制被推測是通過降低腸道屏障通透性、從而減少腸道來源LPS移位至肝臟而間接實現(xiàn)的。從另一個角度看，益生菌不僅能直接調(diào)節(jié)健康人或者實驗動物的腸道免疫功能，還有可能對肝臟的免疫功能產(chǎn)生影響作用。如腸腔內(nèi)細菌合成的、具有抗炎癥作用的短鏈脂肪酸，能通過門靜脈進入

3、肝臟;另外，已有的研究表明，腸腔內(nèi)共生菌能影響肝臟樹突狀細胞的免疫功能。鑒于此，我們提出，益生菌在LPS相關(guān)的肝病模型中的預(yù)防機制，除了保護腸道屏障功能外，是否還有其它機制？如用益生菌預(yù)先處理實驗動物后，是否能影響肝臟的免疫功能從而使得肝臟能直接對抗LPS誘導(dǎo)的損傷或炎癥反應(yīng)？為此，我們希望構(gòu)建一個LPS誘導(dǎo)的動物肝損傷模型:它不同于酒精或D-半乳糖胺誘導(dǎo)的肝損傷模型，即不存在腸道屏障通透性的改變及細菌移位至肝臟，從而盡可能地排除腸道來

4、源的LPS及其它細菌成分對肝臟病理進程的干擾。如果可能，我們用該模型來進一步研究篩選出的益生菌預(yù)先處理動物后，對肝臟損傷和炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用。
　　方法：
　　構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型:用不同劑量LPS（IP;單次處理）處理C57/BL6小鼠后，檢測腸道屏障通透性的變化情況和細菌移位至肝臟的情況。為了進一步研究腸道內(nèi)源性共生菌對LPS誘導(dǎo)的肝損傷的影響，我們比較分析未清腸小鼠和用廣譜抗生素清腸的小鼠在LPS誘導(dǎo)的血清丙氨酸

5、轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及肝臟TNF-α表達水平上的差異。
　　如果某個劑量的LPS處理后，腸道屏障通透性的無顯著變化，腸道共生菌也沒有顯著影響LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α表達水平，則進一步研究益生菌菌株預(yù)先處理對該劑量的LPS誘導(dǎo)的肝損傷的干預(yù)作用。用不同劑量的Lactobacillusfermentum ZYL0401(LF41)、 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)、 Bifidobacterium

6、catenulatum ZYB0401(BC41)（這些菌株懸于500μl PBS中）、或500μl PBS處理（IG;每天一次）小鼠不同天數(shù)，接著用LPS處理，并檢測LPS處理后的肝損傷和炎癥因子表達情況（如檢測血清ALT水平、分析肝臟組織學(xué)變化、檢測肝臟及血清TNF-α表達水平等）。
　　益生菌的作用機制研究:對LPS誘導(dǎo)的肝損傷有顯著抑制作用的益生菌菌株，進一步探索其作用機制。1）評估細菌的作用:如確定益生菌預(yù)先處理后小鼠盲

7、腸和糞便短鏈脂肪酸的水平、腸道通透性是否改變、腸道內(nèi)源性共生菌是否影響菌株處理后肝臟對LPS的拮抗作用、以及菌株在體外是否能直接抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞TNF-α表達等。2）分析益生菌菌株處理后機體免疫功能的變化及作用:首先確定菌株菌種16S rRNA在不同腸段組織的水平，從而篩選出濃度最高的“靶向腸段”;其次，結(jié)合已經(jīng)獲得的一些實驗數(shù)據(jù)及文獻參考，篩選出需檢測的免疫相關(guān)的介質(zhì)及確定它們在“靶向腸段”的基因或蛋白表達情況;如果出現(xiàn)表達顯

8、著改變的介質(zhì)，則進一步分析其在肝臟的表達情況，并研究它們與菌株處理后肝臟獲得的拮抗LPS的損傷作用是否相關(guān)。
　　結(jié)果：
　　用低劑量LPS處理小鼠(0.5mg/kg BW)后，血清ALT和肝臟TNF-α mRNA的表達水平顯著上調(diào)。相比未清腸對照處理，抗生素清腸并無顯著影響LPS誘導(dǎo)的二者的水平。另外，該模型中也不存在腸道屏障通透性的顯著變化和細菌移位至肝臟。
　　高劑量LF41(H-LF41)處理小鼠10天顯著抑制

9、LPS誘導(dǎo)的血清ALT水平、肝臟及血清TNF-α mRNA和蛋白的表達水平、以及肝臟炎癥細胞的浸潤。而滅活的高劑量LF41、低劑量LF41(L-LF41)、高劑量LGG、和高劑量BC41均對LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α mRNA水平無顯著作用。另外，H-LF41處理小鼠21天對LPS誘導(dǎo)的ALT和肝臟TNF-α mRNA水平無顯著影響。
　　用H-LF41處理小鼠10天后:回腸前列腺素E2(PGE2)的分泌和肝臟PGE2的含

10、量均顯著增加;回腸上皮細胞環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達顯著上調(diào)，而肝臟COX-2和COX-1的表達均無顯著變化。H-LF41處理10天上調(diào)回腸黏膜固有層細胞IL-10的表達水平而對肝臟IL-10水平無顯著作用，但擴增了LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10的水平。外源給予的PGE2處理亦顯著擴增LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10水平。H-LF4聯(lián)合EP-4受體抑制劑處理10天后，H-LF41介導(dǎo)的對LPS誘導(dǎo)的肝臟TNF-α mRNA水平的抑制作用消失

11、了;同樣地，PGE2處理亦顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝臟TNF-αmRNA水平。H-LF4聯(lián)合IL-10中和抗體處理10天終結(jié)了H-LF41介導(dǎo)的對ALT水平的抑制作用。PGE2處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的ALT表達。H-LF4聯(lián)合COX-2抑制劑處理10天，不僅終結(jié)H-LF41介導(dǎo)的對回腸和肝臟PGE2表達的上調(diào)作用，而且還消除了其對LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10水平的擴增作用。相比H-LF41單獨處理10天，H-LF41聯(lián)合COX-2抑制劑處理1

12、0天顯著促進肝臟單個核細胞和回腸組織TNF-α的表達，并且顯著增高由TNF-α介導(dǎo)的腸道上皮細胞通透性。
　　結(jié)論：
　　我們發(fā)現(xiàn)在低劑量LPS誘導(dǎo)的肝炎模型中，腸道來源的細菌成分對肝損傷與炎癥因子的表達所起的作用可能很小。H-LF41預(yù)先處理10天能顯著拮抗LPS對肝臟的損傷作用及對TNF-α表達的促進作用。H-LF41處理10天影響了小鼠的固有免疫:即上調(diào)了肝臟PGE2水平，但不伴隨肝臟COX-2和COX-1表達的增強;

13、促進了回腸PGE2分泌，且伴隨回腸COX-2表達的上調(diào)。此外，H-LF41處理10天擴增了LPS誘導(dǎo)的肝臟IL-10表達。重要的是，H-LF41處理誘導(dǎo)的PGE2和IL-10賦予了肝臟拮抗LPS誘導(dǎo)的肝損傷和炎癥因子表達的能力。H-LF41介導(dǎo)的對肝臟PGE2和IL-10水平的上調(diào)作用都受COX-2的控制。COX-2在H-LF41處理10天的小鼠還作為一個預(yù)防機制:即阻止了回腸和肝臟細胞TNF-α表達的上調(diào)及由TNF-α介導(dǎo)的腸道通透性