IL-17A基因敲除減輕LPS誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠炎癥性肝損傷及其機(jī)制研究.pdf

1、隨著物質(zhì)生活水平的提高和現(xiàn)代生活方式的影響，非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver disease，NAFLD)的發(fā)病率和患病人口數(shù)量激增，已成為全球第一大非感染性肝病。美國等西方國家發(fā)病率為20-33％，我國成年人發(fā)病率約12-15％。肥胖和胰島素抵抗是造成NAFLD快速攀升的重要因素。NAFLD疾病譜包括非酒精性單純脂肪肝(Non-alcoholicfatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性

2、肝炎(Non-alcoholic Hepatitis，NASH)及其相關(guān)肝纖維化、肝硬化，少數(shù)可進(jìn)展為肝癌。
　　目的:
　　NASH是單純脂肪肝向肝纖維化及肝硬化發(fā)展的重要階段，以肝細(xì)胞脂肪變性、炎細(xì)胞浸潤和肝小葉纖維化為特征。NASH的發(fā)病機(jī)制以“二次打擊”學(xué)說廣為接受，即胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)和細(xì)胞氧化應(yīng)激等損傷因素。但臨床上針對上述發(fā)病機(jī)制所使用的胰島素增敏劑、抗氧化劑及其聯(lián)合用藥，

3、并不能完全阻斷NASH的進(jìn)展，其根本原因是對NASH的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制并不清楚。近年研究顯示，炎癥免疫在NASH發(fā)病中有重要作用。Th17細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的重要成分，通過抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的功能，分泌IL-17A等細(xì)胞因子，激活枯否細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞極化，參與多種肝臟疾病的發(fā)生。在多種炎癥性肝病，如病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、酒精性肝病和NASH患者的外周血及肝組織中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞數(shù)量及IL-17A表達(dá)水平

4、顯著升高。在LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷及NASH動物模型中也發(fā)現(xiàn)IL-17A的水平升高，并與肝損傷程度顯著正相關(guān)。IL-17A或其特異受體IL-17RA的基因敲除能顯著減輕高脂誘導(dǎo)小鼠NASH的進(jìn)展。采用IL-17A抗體中和內(nèi)源性IL-17A能有效減輕LPS誘導(dǎo)的肝損傷。但I(xiàn)L-17A基因敲除如何減輕肝損傷的機(jī)制并未闡明。本研究以IL-17A基因敲除小鼠為對象，通過高脂膳食誘導(dǎo)脂肪肝，并給予低劑量LPS刺激誘導(dǎo)肝損傷為模型，觀察IL-17A

5、基因缺失在脂肪肝小鼠肝損傷中的作用和機(jī)制。本研究旨在為臨床上以肝脂肪變性為基礎(chǔ)的炎性損傷機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　(1)脂肪性肝炎癥損傷小鼠模型的建立:以基因敲除(KO)IL-17A（IL-17A-/-）小鼠為工具，采用6個月長程高脂飲食(HF)輔助一次性LPS（4mg/kg體重）刺激模擬急性炎癥刺激誘導(dǎo)脂肪肝炎癥性損傷，以普通飼料組(Chow)小鼠為對照。動物共分四組:野生型(WT)正常膳食組(n=7)，野生型高

6、脂膳食+LPS組(n=7)，IL-17A KO正常膳食組(n=7)，IL-17A KO高脂膳食+LPS組(n=7)。
　　(2)IL-17A-/-敲除小鼠鑒定:方法一:剪尾，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增鑒定基因敲除小鼠中特有的載體DNA片段;方法二:酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血漿IL-17A水平。
　　(3)小鼠生長發(fā)育體征及攝食量的檢測:測定小鼠體重、體長、尾長、攝食量的測定。
　　(4)小鼠肝臟及血液生化代謝

7、指標(biāo)的檢測:血漿甘油三酯、總膽固醇和游離脂肪酸含量測定。
　　(5)小鼠肝損傷的評估:測定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶，TUNEL法檢測了肝臟實質(zhì)細(xì)胞的凋亡情況，HE染色觀察肝臟組織形態(tài)。
　　(6)血漿和肝臟炎癥因子的檢測:ELISA測定血漿和肝臟TNF-α、IL-6和IL-1β水平測定。
　　(7)小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析:每組小鼠選取3只，4組動物，共12個樣品，Trizol法提取肝臟總RNA，全基因表達(dá)譜芯片分析交由

8、上?？党缮镉邢薰具M(jìn)行。
　　(8)小鼠肝臟蛋白組學(xué)分析:每組小鼠選取3只，4組動物，采用iTRAQ技術(shù)對4組小鼠肝臟的蛋白質(zhì)表達(dá)譜及其含量進(jìn)行相對定量及分析，此部分交由深圳華大科技有限公司進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　(1)IL-17A基因敲除不影響小鼠的一般發(fā)育情況，小鼠的體重、體長、尾長及攝食量正常膳食及高脂膳食喂養(yǎng)條件均無顯著差別。
　　(2)6個月高脂膳食喂養(yǎng)后，小鼠肝臟脂肪變性嚴(yán)重高于正常飲食小鼠，小

9、鼠血漿甘油三酯，總膽固醇和游離脂肪酸測定結(jié)果顯示:與Chow小鼠相比較，HF小鼠血漿的甘油三酯、總膽固醇水平均顯著升高，游離脂肪酸的含量則無明顯差異;KO小鼠進(jìn)食Chow或HF，兩組小鼠的血漿代謝指標(biāo)均無顯著差異。
　　給予脂肪肝小鼠急性LPS刺激(HF+LPS)，相比較于WT小鼠，IL-17A-/-基因敲除顯著降低小鼠血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(p＜0.05)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(p＜0.05)水平，肝臟炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，肝臟和血漿中IL-1β

10、、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低。TUNEL法檢測肝臟實質(zhì)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示:IL-17A-/-小鼠肝臟中凋亡細(xì)胞數(shù)量較野生型小鼠顯著減少(p＜0.001)。
　　肝臟轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示:HF+LPS刺激下，兩組小鼠間共有938個基因被顯著影響，而這部分基因主要富集于Oxidation Reduction Process(p=0.00017)，HydrogenPeroxide Metabolic Process(p=0.00

11、26), Glutathione Metabolic Process(p=0.0048)。肝臟蛋白質(zhì)學(xué)分析顯示:在該刺激條件下，差異蛋白質(zhì)分子主要富集于Response to oxidativestress(p＜=0.0361), Response to reactive oxygen species(p=0.0047), Response to hydrogenperoxide(p=0.0165)，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。
　　(5)

12、 qPCR驗證肝臟過氧化氫代謝轉(zhuǎn)化相關(guān)酶的mRNA表達(dá)水平表明:HF+LPS刺激下，IL-17A-/-小鼠肝臟中CAT(p＜0.05)、GPX1(p＜0.05)、IDH1(p＜0.05)、IDH2(p＜0.05)以及ME1(p＜0.05) mRNA表達(dá)水平明顯高于WT小鼠; IL-17A KO小鼠肝臟CAT酶活性(p＜0.001)和NADPH含量(p＜0.01)顯著高于WT小鼠;肝臟MDA含量較WT小鼠顯著減少(p＜0.001)，總抗氧

13、化水平T-AOC顯著高于WT小鼠(p＜0.05)。
　　(6)免疫組化顯示在HF+LPS刺激下，肝臟中抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NRF2的細(xì)胞核定位顯著高于WT小鼠。
　　(7)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組中趨化因子及配體的表達(dá)情況還顯示，KO小鼠在HF+LPS刺激下有24種趨化因子的mRNA表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些趨化因子主要參與中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和Th1細(xì)胞的趨化。此外，對蛋白質(zhì)組差異蛋白質(zhì)的分析還發(fā)現(xiàn):與M2型巨噬細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以

14、及氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)分子表達(dá)與WT小鼠存在顯著差異。
　　結(jié)論:
　　(1)在HF+LPS刺激下，IL-17A基因敲除顯著減輕LPS誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠炎癥性損傷;
　　(2)在HF+LPS刺激下，IL-17A基因敲除顯著增強(qiáng)肝臟過氧化氫代謝轉(zhuǎn)化能力，減輕小鼠肝臟氧化應(yīng)激損害;
　　(3)在HF+LPS刺激下，IL-17A基因敲除顯著增加肝臟NRF2轉(zhuǎn)核，從而顯著上調(diào)過氧化氫清除相關(guān)酶的mRNA表達(dá)水平;