利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝及部分作用機(jī)理.pdf

1、背景和目的：利福平是臨床廣泛應(yīng)用的抗結(jié)核藥物，眾所周知利福平具有肝毒性。以往臨床關(guān)注的是利福平對(duì)肝細(xì)胞的損傷，而利福平對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其機(jī)制鮮有報(bào)道。本課題擬在建立利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕A(chǔ)上，觀(guān)察利福平引起的小鼠肝臟脂肪變及其動(dòng)態(tài)演變過(guò)程，并進(jìn)一步探討其可能的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：為觀(guān)察利福平引起的小鼠肝脂肪變，將42只健康雄性成年小鼠隨機(jī)分成7組，分別為對(duì)照組，利福平處理8小時(shí)(8 h)組、24小時(shí)(24 h)組

2、、3天(3 d)組、1周(1 wk)組、2周(2 wk)組、4周(4 wk)組，其中8 h組、24 h組于清晨9點(diǎn)鐘灌胃給予利福平200 mg/kg一次后于對(duì)應(yīng)時(shí)點(diǎn)剖殺取材；3 d組、1 wk組、2 wk組、4 wk組均于每日清晨9點(diǎn)鐘連續(xù)經(jīng)口灌胃給予利福平200 mg/kg,后于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)剖殺取材。所有小鼠剖殺前均禁食6小時(shí)。采集小鼠血及肝臟組織，稱(chēng)取小鼠肝臟重量。計(jì)算小鼠肝臟系數(shù)；分離血清檢測(cè)小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平；

3、HE染色法觀(guān)察小鼠肝臟組織病理學(xué)改變；檢測(cè)小鼠血清中膽固醇酯（TCH），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白（VLDL），高密度脂蛋白（HDL）水平；檢測(cè)肝臟組織中TG相對(duì)含量及總含量；用油紅O染色法檢測(cè)小鼠肝臟組織中肝臟脂質(zhì)沉積情況。選取對(duì)照組、利福平處理3 d組、1 wk組、4 wk組，用RT-qPCR方法檢測(cè)肝細(xì)胞中參與肝臟脂質(zhì)從頭合成的酶及調(diào)節(jié)因子（Acc、Fas及Scd-1）,脂肪酸氧化相關(guān)酶（Cpt-1α、Cyp4a10和Cyp4

4、a14），脂肪酸攝取相關(guān)酶及調(diào)節(jié)因子（Cd36、Fatp、L-fabp）和 Pparγ mRNA水平；用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞中SREBP-1c、LXR-α、PXR、PPARγ核蛋白及PPARγ總蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，利福平處理各組小鼠肝臟重量、肝臟系數(shù)從24 h組開(kāi)始均呈逐漸升高趨勢(shì)，于4 wk組達(dá)峰值。利福平處理24 h，3 d及1 wk組ALT水平較對(duì)照組升高；而利福平處理4 wk組較其顯著升高。

5、HE染色結(jié)果顯示，利福平處理8h、24h組肝臟組織與對(duì)照組未見(jiàn)明顯變化；利福平處理3d組可見(jiàn)較多小的圓形空泡；而從1 wk組開(kāi)始，小鼠肝組織可觀(guān)察到明顯增多的大的圓形空泡。利福平處理8 h，24 h組小鼠血清TG，VLDL水平較對(duì)照組升高，3 d組時(shí)顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而1 wk組開(kāi)始則較對(duì)照組呈顯著下降趨勢(shì)。與對(duì)照組相比利福平處理各組小鼠血清中TCH，HDL則呈逐漸降低趨勢(shì)。利福平處理小鼠各組織TG含量則從8 h組即升高，1 w

6、k時(shí)最明顯。肝臟組織油紅O染色顯示，利福平處理8h、24h組肝組織可見(jiàn)少量圓形脂滴；3d組開(kāi)始出現(xiàn)顯著增加的大的圓形脂滴。用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),利福平處理3 d、1 wk、4 wk組與脂肪酸從頭合成有關(guān)的酶Acc、Fas、Scd-1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組均明顯上調(diào)；進(jìn)一步檢測(cè)SREBP-1c核蛋白表達(dá)水平，利福平處理各組 SREBP-1c核蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，另一上游調(diào)節(jié)因子 LXR-α核蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組

7、也無(wú)顯著變化；用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)各組與脂肪酸氧化相關(guān)酶Cpt-1α、Cyp4a10及Cyp4a14 mRNA表達(dá)水平，利福平處理各組Cpt-1α、Cyp4a10及Cyp4a14 mRNA呈逐漸上調(diào)趨勢(shì)；用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)各組與脂肪酸攝取有關(guān)酶Cd36、Fatp及L-Ffabp mRNA表達(dá)水平，利福平處理各組Cd36、Fatp mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組是上調(diào)的，而L-Ffabp mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組無(wú)明顯變化；檢測(cè)肝臟組

8、織中PPARγmRNA、總蛋白及核蛋白表達(dá)水平，其表達(dá)較對(duì)照組均明顯上調(diào)；進(jìn)一步檢測(cè)肝臟組織內(nèi)PXR核蛋白水平及其下游目的基因Cyp3a11 mRNA表達(dá)水平，利福平處理各組PXR核蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯增多，Cyp3a11 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：1.利福平能引起小鼠肝臟組織脂質(zhì)沉積，且具有時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；2.利福平通過(guò)非依賴(lài)SREBP-1c及LXR-α激活途徑上調(diào)參與肝臟脂肪酸從頭合成途徑相關(guān)酶的表達(dá)