淫羊藿素減輕急性肝損傷及其分子機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景與目的] 淫羊藿素是近年來倍受關(guān)注的具有抗氧化、防治骨質(zhì)疏松、心血管疾病、保護(hù)神經(jīng)變性損傷、防治乳腺癌的單體藥物。用于分離淫羊藿素的箭葉淫羊藿，自古以來是一種重要的傳統(tǒng)中草藥。淫葉藿經(jīng)多重步驟的萃取與硅膠層析、洗脫后，可制得淫羊藿素。 淫羊藿素與其前體物質(zhì)淫羊藿苷具有極其相似的分子結(jié)構(gòu)。其不同之處在于A環(huán)7位的糖苷鏈被羥基所代替(見圖1)。從藥物構(gòu)效關(guān)系的角度推測(cè)其抗氧化功能將進(jìn)一步增強(qiáng)。目前有關(guān)淫羊藿素的研究

2、證實(shí)：1、通過降低前列腺癌細(xì)胞線粒體的跨膜電勢(shì)，減少pRb、Cyclin D1及CDK4蛋白的磷酸化使前列腺癌細(xì)胞阻制于G1期從而產(chǎn)生抑制癌細(xì)胞增殖的作用；2、原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿素可通過擬雌激素樣作用引起細(xì)胞增殖，減輕β樣淀粉酶對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷；3、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化；4、可通過抑制酪氨酸蛋白激酶的表達(dá)、減輕細(xì)胞縫隙間連接蛋白的損傷減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧損傷；5、通過其抗氧化作用可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制破骨細(xì)胞，從

3、而防治骨質(zhì)疏松癥。 各種原因?qū)е碌母螕p傷是臨床工作中經(jīng)常遇到的問題，肝臟保護(hù)一直是研究的熱點(diǎn)問題。有關(guān)肝損傷保護(hù)藥物的研究、基因治療、外科干預(yù)措施等一直是較為活躍的領(lǐng)域之一，但仍缺乏高效的多靶點(diǎn)的保肝藥物。肝損傷的病理過程中，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的氧化作用是主要的損傷途徑。結(jié)合淫羊藿素已有的研究背景，我實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)證實(shí)淫羊藿素可以減輕脂肪肝小鼠的缺血再灌

4、注損傷。我們推測(cè)其可能存在減輕急性化學(xué)性肝損傷的藥理作用，有望成為治療肝損傷的治療藥物。本研究著重進(jìn)行淫羊藿素瘁滅活性氧簇、擬雌激素樣作用調(diào)節(jié)肝細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，初步評(píng)價(jià)淫羊藿素治療急性肝損傷的作用，探討其可能的分子機(jī)制。 [研究方法] 1淫羊藿素減輕CCL4誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞損傷的體外實(shí)驗(yàn)：建立大鼠肝細(xì)胞CCL4損傷模型，以淫羊藿苷為陽性對(duì)照藥物，在不同劑量淫羊藿素作用下，應(yīng)用MTT法測(cè)定藥物作用前后

5、細(xì)胞存活率的變化、自動(dòng)生化分析儀測(cè)定培養(yǎng)上清ALT、AST的含量、分光光度法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清MDA、細(xì)胞內(nèi)SOD的變化，熒光顯微鏡觀察肝細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)弱的變化，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2淫羊藿素減輕CCL4誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)：建立大鼠肝細(xì)胞CCL4凋亡模型，以ICI182，780作為雌激素受體阻斷藥物，應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)不同濃度淫羊藿、不同作用時(shí)間后肝細(xì)胞PPARα和L-FABP蛋白以及BCL

6、-2/BAX凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化、細(xì)胞免疫化學(xué)染色檢測(cè)肝細(xì)胞L-FABP的表達(dá)水平、流式細(xì)胞儀及TUNNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡比率及形態(tài)學(xué)變化，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 3淫羊藿素減輕CCL4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：利用去勢(shì)C57BL/6雌性小鼠建立CCL4急性肝損傷動(dòng)物模型。以雌激素為陽性對(duì)照藥物、ICI182，780作為雌激素受體阻斷藥物，利用分光光度計(jì)測(cè)定血清ALT、AST的含量及肝組織MDA、SOD的變化、R

7、ealtime-PCR方法檢測(cè)肝組織內(nèi)PPARα和L-FABP轉(zhuǎn)錄水平的變化、HE組織切片染色評(píng)估肝組織損傷的差異、組織免疫化學(xué)染色測(cè)定肝組織L-FABP蛋白的表達(dá)水平、TUNNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞的凋亡比例及形態(tài)學(xué)變化，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 體外實(shí)驗(yàn) 1淫羊藿素對(duì)CCL4損傷大鼠肝細(xì)胞存活率的影響：隨著淫羊藿素濃度的升高，CCL4損傷后的大鼠肝細(xì)胞存活率逐漸增加，且呈濃度依賴性。但濃度上升至1

8、0μmol/L時(shí)細(xì)胞活力不再升高，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在同樣濃度下淫羊藿素提高肝細(xì)胞存活率的能力大約是淫羊藿苷的兩倍。 2淫羊藿素對(duì)CCL4損傷大鼠肝細(xì)胞后培養(yǎng)上清ALT、AST的影響：淫羊藿素可減少ALT、AST的釋放，在0.1uM-10uM范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。淫羊藿素0.1uM，1uM，10uM組與模型組比較顯著降低(P＜0.05)，淫羊藿苷10uM組與模型組比較顯著降低(P＜0.01)。淫羊藿素10uM組與淫羊藿苷10uM組比

9、較降酶作用更強(qiáng)，前者約為后者的兩倍。 3淫羊藿素對(duì)CCL4損傷大鼠肝細(xì)胞后MDA、SOD及ROS的影響：淫羊藿素在0.1～100uM劑量范圍內(nèi)，可降低培養(yǎng)上清MDA的含量，并恢復(fù)肝細(xì)胞的SOD活性，且呈明顯的劑量依賴性。淫羊藿素減少活性氧簇的產(chǎn)生，相對(duì)于Icariin10uM組，Icaritin10uM組的ROS熒光度更低。 4淫羊藿素對(duì)CCL4損傷肝細(xì)胞后PPAR-α和L-FABP影響：不同濃度的淫羊藿素作用不同時(shí)間大

10、鼠肝細(xì)胞內(nèi)PPAR-α、L-FABP蛋白的表達(dá)逐漸增多，且呈藥物濃度與時(shí)間依賴性。Western-blot、細(xì)胞免疫組化方法均顯示正常對(duì)照組PPAR-α、L-FABP有一定水平的表達(dá)，CCL4損傷后表達(dá)下降，而1uM淫羊藿素組的表達(dá)則顯著增高，1uM Icaritin+ICI182，780組表達(dá)則顯著降低(P＜0.01)。 5淫羊藿素對(duì)CCL4損傷大鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及其細(xì)胞凋亡比率的影響：模型組、載體組的Bcl-2/Bax明

11、顯下降，而給予不同濃度淫羊藿素作用后，Bcl-2/Bax呈升高表現(xiàn)，其趨勢(shì)呈劑量依賴性。ICI182，780阻斷后，Bcl-2/Bax比值明顯下降(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀及TUNNEL法檢測(cè)顯示1uM Icaritin處理后細(xì)胞凋亡率顯著低于模型組與DMSO載體對(duì)照組(P＜0.01)。1uM Icaritin組細(xì)胞凋亡率明顯低于1uMIcaritin+ICI182.780組(P＜0.05)。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 1淫羊藿素對(duì)急

12、性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響：1mg/Kg淫羊藿素組的ALT、AST低于模型組、載體組、Estrogen組(P＜0.05)，1mg/Kg Icaritin+ICI182，780組與1mg/Kg Icaritin組比較ALT、AST有顯著升高(P＜0.01)。 2淫羊藿素對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織MDA、SOD的影響：1mg/Kg Icaritin組與Estrogen組比較，MDA、SOD顯著差異(P＜0.05)。Icarit

13、in+ICI182，780組與1mg/KgIcaritin組比較差異顯著(P＜0.05)。 3淫羊藿素對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織PPARα、L-FABPmRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響：損傷模型組及載體組，PPAR-α未見明顯變化，而L-FABP呈一定程度的下降(與對(duì)照組比較P＜0.05)。在1mg/Kg Icaritin組二者轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高(P＜0.01)。E2組的PPAR-α、L-FABP的轉(zhuǎn)錄水平亦較模型組及載體組明顯升高(P＜0.

14、01)，并且高于Icaritin組，但二者無顯著差異(P＞0.05)。在ICI182780組，PPAR-α、L-FABP的轉(zhuǎn)錄水平較Icaritin組、雌激素組明顯下降(P＜0.01)。L-FABP抗體免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組及載體組的染色范圍及染色強(qiáng)度弱于較對(duì)照組。而1mg/Kg淫羊藿素組、雌激素組表達(dá)則明顯增強(qiáng)(P＜0.01)，1mg/Kg淫羊藿素+ICI182，780組則減弱(P＜0.01)。 4淫羊藿素對(duì)急性肝損

15、傷小鼠肝組織損傷程度的影響：模型組和載體組小鼠肝損傷組織學(xué)積分為3分，而1mg/Kg淫羊藿素組、雌激素組積分分別為0.8，1.2分，與模型組與載體組比較差異顯著(P＜0.01)，淫羊藿素+ICI182，780組的積分為1.4分，與1mg/Kg淫羊藿素組比較有顯著差異(P＜0.05)。 5淫羊藿素對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織的凋亡指數(shù)變化：1mg/Kg淫羊藿素組肝細(xì)胞的凋亡比率明顯低于模型組與載體組(P＜0.01)。1m/Kg淫羊藿素+

16、ICI182，780組凋亡數(shù)量顯著增多，凋亡率明顯高于淫羊藿素與雌激素處理組(P＜0.05)。 [結(jié)論] 1淫羊藿素有較強(qiáng)的瘁滅活性氧簇的藥理作用，可以減輕肝細(xì)胞過氧化損傷。 2淫羊藿素可通過擬雌激素作用上調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)L-FABP蛋白的表達(dá)，從而通過基因途徑提高肝細(xì)胞的抗氧化能力。 3淫羊藿素可通過上調(diào)Bcl-2/Bax比值減輕氧化損傷誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。 4淫羊藿素是一種有效、多靶點(diǎn)的減輕急性肝損傷