聲預(yù)處理對(duì)急性聲損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分聲預(yù)處理對(duì)急性聲損傷的保護(hù)作用及耳蝸形態(tài)學(xué)改變的影響
　　目的：通過建立聲預(yù)處理和急性聲損傷SD大鼠動(dòng)物模型，明確聲預(yù)處理對(duì)大鼠聽力的保護(hù)作用及其對(duì)急性聲損傷所致耳蝸組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的影響。
　　方法：將20只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機(jī)分組的原則，分為四組即：正常對(duì)照組（Ctrl，5只）、聲預(yù)處理組（SC，5只）、噪聲暴露組（NE，5只）和聲預(yù)處理+噪聲暴露組（SC+NE，5只）。其中噪

2、聲暴露組給予聲強(qiáng)為115dB SPL白噪聲每天6小時(shí)，連續(xù)兩天；聲預(yù)處理組給予聲強(qiáng)為85dB SPL純音500Hz24小時(shí)；聲預(yù)處理+噪聲暴露組則在先后給予聲預(yù)處理和噪聲暴露之間休息3小時(shí)；正常對(duì)照組不給予任何噪聲接觸，但其他方面均與造模組相同。于造模前以及造模后1天，分別采用ABR聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response）檢測SD大鼠雙耳聽覺反應(yīng)閾值，在聽覺功能上觀察聲預(yù)處理和噪聲暴露對(duì)大鼠聽力的影響。遂后

3、采用基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽染色激光共聚焦和掃描電鏡觀察不同組SD大鼠耳蝸各轉(zhuǎn)毛細(xì)胞形態(tài)變化，在形態(tài)學(xué)上證實(shí)聲預(yù)處理和噪聲暴露對(duì)SD大鼠耳蝸外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響；同時(shí)常規(guī)透射電鏡觀察各組大鼠耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，在形態(tài)學(xué)上證實(shí)聲預(yù)處理和噪聲暴露對(duì)SD大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：聽覺腦干誘發(fā)電位（ABR）Click聲和純音檢測聽力閾值，結(jié)果均顯示噪聲暴露前給予聲預(yù)處理的大鼠聽閾明顯低于單純?cè)肼暠┞兜拇笫舐?/p>

4、閾，且兩者聽閾差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而造模后聲預(yù)處理組和正常組兩者聽閾在統(tǒng)計(jì)學(xué)上未見明顯差異（P>0.05）。基底膜鋪片鬼筆環(huán)肽染色和掃描電鏡均證實(shí)了聲預(yù)處理對(duì)各轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞功能性的結(jié)構(gòu)重塑，即：底轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，纖毛變短變粗且方向一致；中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞纖毛極性消失，排列不齊且松散，有少量出現(xiàn)纖毛排列紊亂，但無明顯纖毛倒伏、融合和消失；并且與單純?cè)肼暠┞断啾?，噪聲暴露前給予聲預(yù)處理其各轉(zhuǎn)三排外毛細(xì)胞缺失明顯

5、減少，外毛細(xì)胞纖毛變短但排列尚整齊，無明顯纖毛倒伏、融合和消失；外毛細(xì)胞計(jì)數(shù)表明噪聲暴露前給予聲預(yù)處理在底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失率上明顯低于單純?cè)肼暠┞?，且兩者差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但兩者在頂轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞缺失率未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。另外，透射電鏡觀察證實(shí)聲預(yù)處理后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，線粒體數(shù)量有所增加，線粒體內(nèi)嵴電子密度增高，內(nèi)嵴間隙明顯變窄；而噪聲暴露后耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞皺縮，與鞘膜出現(xiàn)分離，線粒

6、體腫脹變形且數(shù)量減少，內(nèi)嵴電子密度降低，出現(xiàn)斷裂、融合、消失，內(nèi)嵴間隙明顯增寬，大量空泡形成；同時(shí)較單純?cè)肼暠┞?，噪聲暴露前給予聲預(yù)處理其耳蝸軸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞皺縮和分離不明顯，線粒體無明顯腫脹變形，內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)完整且電子密度增高，內(nèi)嵴間隙明顯變窄，未見內(nèi)嵴斷裂、融合、消失，偶有空泡形成。同時(shí)，耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體計(jì)數(shù)表明噪聲暴露后螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體密度明顯減?。≒<0.05），而聲預(yù)處理后螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體密度有明顯增加（P<0.0

7、5）。
　　結(jié)論：聲預(yù)處理對(duì)大鼠急性聲損傷有一定的聽力保護(hù)作用，且對(duì)大鼠聽力無明顯損傷。在形態(tài)學(xué)上，聲預(yù)處理對(duì)噪聲暴露所致大鼠底轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞損傷有一定保護(hù)作用；但對(duì)大鼠頂轉(zhuǎn)外毛細(xì)胞損傷保護(hù)作用不明顯。另外，噪聲暴露破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)，對(duì)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體功能有明顯損傷作用，而聲預(yù)處理可明顯提高線粒體的數(shù)量和功能狀態(tài)，在一定程度上抑制了噪聲暴露對(duì)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體的損傷和破壞。
　　第二部分聲預(yù)處理保護(hù)作用分子機(jī)制的在

8、體研究
　　目的：闡明聲預(yù)處理通過調(diào)節(jié)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和提高線粒體功能狀態(tài)發(fā)揮保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，從而指導(dǎo)臨床急性聲損傷的聲預(yù)處理治療，并提供新的思路和理論支持。
　　方法：將80只健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠按照完全隨機(jī)分組的原則，分為四組即：正常對(duì)照組（Ctrl，20只）、聲預(yù)處理組（SC，20只）、噪聲暴露組（NE，20只）和聲預(yù)處理+噪聲暴露組（SC+NE，20只）。其中噪聲暴露組給予聲強(qiáng)

9、為115dB SPL白噪聲每天6小時(shí)，連續(xù)兩天；聲預(yù)處理組給予聲強(qiáng)為85dB SPL純音500Hz24小時(shí)；聲預(yù)處理+噪聲暴露組則在前后給予聲預(yù)處理和噪聲暴露之間休息3小時(shí)；正常對(duì)照組不給予任何噪聲接觸，但其他方面均與造模組相同。造模后采用RT-PCR、免疫熒光染色和Western blot蛋白印跡方法分別檢測各組SD大鼠Hsp70、Bmi1、SOD1、SOD2 mRNA和蛋白表達(dá)以及AKT蛋白磷酸化水平變化。
　　結(jié)果：免疫熒光

10、染色和Western blot蛋白印跡結(jié)果顯示：Hsp70蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞）中均有一定程度表達(dá)；噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70蛋白表達(dá)，但其周圍的支持細(xì)胞可以部分代償性維持Hsp70蛋白表達(dá)；而聲預(yù)處理能明顯提高螺旋神經(jīng)元細(xì)胞 Hsp70蛋白表達(dá)，在一定程度上抑制了噪聲暴露對(duì)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70蛋白表達(dá)的下調(diào)。而Bmi1蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞）中亦均有一定

11、程度表達(dá)，噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1蛋白表達(dá)，但其周圍的支持細(xì)胞卻代償性提高Bmi1蛋白表達(dá)；而聲預(yù)處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 Bmi1蛋白表達(dá)并轉(zhuǎn)位于線粒體內(nèi)，在一定程度上可以抑制噪聲暴露對(duì)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1蛋白表達(dá)的下調(diào)，這與Hsp70表達(dá)具有時(shí)間和空間上的一致性。另外，SOD1、SOD2蛋白在正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（包括螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞）中亦均有一定程度表達(dá)；噪聲暴露降低了螺旋神經(jīng)元細(xì)胞和支持細(xì)胞SOD1、S

12、OD2蛋白表達(dá)；而聲預(yù)處理亦能明顯提高螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá)，在一定程度上可以抑制噪聲暴露對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá)的下調(diào)。同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示：較正常對(duì)照組，聲預(yù)處理組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Hsp70、Bmi1、SOD1和SOD2 mRNA表達(dá)均明顯提高。
　　結(jié)論：聲預(yù)處理誘導(dǎo)上調(diào)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Hsp70 mRNA和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)了神經(jīng)元細(xì)胞自身的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1、SOD

13、1和SOD2的mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)及 Bmi1蛋白的線粒體轉(zhuǎn)位也參與了聲預(yù)處理對(duì)噪聲暴露所致急性聲損傷的保護(hù)作用，其中誘導(dǎo)抗氧化基因SOD1和SOD2蛋白表達(dá)上調(diào)與 Hsp70和Bmi1蛋白表達(dá)上調(diào)均具有時(shí)間和空間上的一致性。
　　第三部分相關(guān)分子機(jī)制的體外研究
　　目的：為進(jìn)一步證實(shí)聲預(yù)處理可能激活的分子調(diào)控機(jī)制，闡明螺旋神經(jīng)元細(xì)胞抗氧化基因SOD1和SOD2可能是Hsp70和Bmi1的下游調(diào)控分子靶點(diǎn)。
　　方

14、法：新生SD大鼠仔鼠耳蝸螺旋神經(jīng)元細(xì)胞取材培養(yǎng)1天后，完全隨機(jī)分為：正常對(duì)照組和Bmi1抑制劑組，其中正常對(duì)照組除按需更換細(xì)胞培養(yǎng)液外加入與抑制劑組相同體積的DMSO溶液，而 Bmi1抑制劑組除按需更換細(xì)胞培養(yǎng)液外加入1μ M PTC-209溶液（DMSO為溶劑）；培養(yǎng)兩天后細(xì)胞爬片免疫熒光染色并熒光顯微鏡觀察各組體外培養(yǎng)大鼠螺旋神經(jīng)元細(xì)胞Bmi1、SOD1、SOD2和Hsp70的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：Bmi1高選擇性抑制劑PTC