rHuEPO預(yù)處理對大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)是常見的臨床病理生理過程，是肝切除術(shù)、肝移植、肝外傷、失血性和心源性休克等疾病共同經(jīng)歷的一個多因素參與的過程。HIRI是術(shù)后肝功能異常、原發(fā)性肝移植無功能、肝功能衰竭的重要原因。研究表明，HIRI是影響肝移植術(shù)后移植物長期存活的危險因素。如何干預(yù)HIRI導(dǎo)致的肝功能損害以及保護肝臟功能，愈來愈受到全球重視。探索防治HIRI的藥物已成為

2、當前研究熱點。
　　 為了減輕肝臟缺血再灌注損傷，許多學者做了大量的研究，如縮短缺血時間、缺血預(yù)處理、缺血后處理及藥物處理等，從而達到減輕肝細胞損傷的目的。藥物處理是針對缺血再灌注的某個或某些機制利用藥物的藥理作用，減少再灌注損傷過程中產(chǎn)生的氧自由基、鈣超載、炎性介質(zhì)等或利用某些活性物質(zhì)直接或間接的藥理作用來增強肝組織或肝細胞對缺血再灌注損傷的耐受能力，減輕組織或細胞的損傷，從而達到保護的作用。促紅細胞生成素（erythropo

3、ietin, EPO）由髓質(zhì)與腎皮質(zhì)交界處的球旁細胞合成的，能刺激骨髓造血的唾液糖蛋白類激素，促進紅細胞的生成是其基本作用。
　　 EPO可通過與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細胞、實體腫瘤、子宮等多種非紅系組織細胞表達的促紅細胞生成素受體(erythropoietin recptor, EPOR)結(jié)合，形成EPO-EPOR信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，參與多種非造血生物活動，并對細胞和組織器官有保護作用。
　　 在肝臟疾病的治療過程中，使用重組人

4、紅細胞生成素(recombinant humanerythropoietin, rHuEPO)治療小鼠和大鼠，能夠顯著降低缺血再灌注所致?lián)p傷，包括肝臟組織病理學分數(shù)、酶學指標、細胞凋亡、有害細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和活性氧作用。研究表明，rHuEPO體內(nèi)對缺血再灌注和其他原因引起的肝損傷保護，并不是直接作用于肝細胞，推測rHuEPO可能直接或間接地作用于非肝實質(zhì)細胞如肝竇內(nèi)皮細胞和kupffer細胞等減輕肝臟損傷。因此，值得深入探討rHuEPO對

5、肝臟缺血再灌注損傷的保護作用和機制。
　　 本文采用大鼠自體肝移植動物模型，模擬肝移植過程中肝臟經(jīng)歷缺血再灌注損傷的過程，通過研究血清中肝臟酶學指標的變化，肝臟病理形態(tài)學改變，肝細胞凋亡等，觀察rHuEPO預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。并結(jié)合調(diào)控細胞存活的關(guān)鍵信號通路-磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)信號通路的變化，探討rHuEPO的作用機制，為研究rHuEPO預(yù)處

6、理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用提供科學依據(jù)。
　　 第一部分、大鼠自體肝移植模型的建立情況
　　 目的：肝移植動物模型是肝移植實驗研究的非常重要的基礎(chǔ)。Kamada提出的“雙套袖法”大鼠肝移植是目前應(yīng)用較廣泛且成熟的肝移植動物模型，但此模型不吻合肝動脈。而本中心建立的大鼠自體肝移植動物模型，能模擬臨床肝移植過程，完全排除免疫、血管吻合等因素，全面反映肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過程?，F(xiàn)總結(jié)該動物模型建立情況以及術(shù)中、術(shù)

7、后管理經(jīng)驗，以期該模型成功率高、重復(fù)性好。
　　 方法：
　　 1.實驗動物SPF級純系、雄性的SD大鼠55只，其中27只大鼠用于早期動物模型建立訓練。另28只大鼠按照實驗設(shè)計的要求和藥物預(yù)處理的方案進行實驗，其中假手術(shù)組(sham)3只，其余各組I/R，I/R+rHuEPO，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO+LY294002，I/R+LY294002組，每組5只大鼠。
　　 2.手術(shù)操作經(jīng)術(shù)前準備后，充分

8、游離肝周結(jié)構(gòu)，在使肝臟肝素化(含肝素37.5 U/ml)后，使用4℃含肝素（12.5 U/ml）的復(fù)方乳酸林格氏液經(jīng)門靜脈、腹主動脈雙重恒壓冷灌注。除冷灌注保存以及血管吻合操作外，其余方法同大鼠原位肝移植。
　　 3.觀察時間及內(nèi)容SD大鼠的觀察的時間點分別為24 h，48 h，72 h，觀察大鼠的生存質(zhì)量和存活情況。
　　 4.統(tǒng)計方法運用SPSS13.0軟件繪制生存曲線。
　　 結(jié)果：
　　 1.以肝

9、素化大鼠時阻斷門靜脈到開始冷灌注為熱缺血時間，到門靜脈開放為無肝期。為標準化研究實驗對象，其中熱缺血時間為2.5-3.5min、冷灌注時間均統(tǒng)一為15min。將無肝期時間設(shè)定為30 min。
　　 2.在實驗初期，大鼠存活滿足實驗設(shè)計要求達到92.31％。在研究實驗藥物對大鼠72 h生存率影響時，發(fā)現(xiàn)使用LY294002(PI3K特異性抑制劑)預(yù)處理組的存活率低。
　　 小結(jié)：
　　 自體移植的動物模型完全符合實

10、驗設(shè)計要求。手術(shù)操作時，應(yīng)嚴格按照動物實驗的基本原則，注意小細節(jié)處理，能顯著改善大鼠術(shù)后恢復(fù)過程，甚至可以直接影響實驗動物的存活。
　　 第二部分、rHuEPO預(yù)處理對大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護作用
　　 目的：建立的自體肝移植缺血再灌注損傷模型，從血清中肝臟酶學指標變化、肝臟病理形態(tài)改變和肝細胞凋亡三方面，初步探討rHuEPO對大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷的保護作用。
　　 方法：
　　 1.建

11、立自體肝移植的動物模型（同第一部分）。
　　 2.實驗動物 SD大鼠隨機60只，分成3組:①GroupⅠ:假手術(shù)組(Sham)20只。本組實驗對象僅游離肝臟不給藥。②GroupⅡ:缺血再灌注組(I/R)20只。術(shù)前30 min經(jīng)尾靜脈給予1ml0.9％生理鹽水(normal saline，NS)。③GroupⅢ:rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)20只。本組實驗對象行自體原位肝移植手術(shù)。在術(shù)前30min，經(jīng)尾靜脈給予按

12、照體重（Kg）×3000 U/kg的rHuEPO并將混合在0.9％NS中，容積為1ml。除Sham組外，所有大鼠行自體肝移植手術(shù)，均經(jīng)歷15min冷灌注時間，30 min的無肝期。
　　 3.標本的采集和處理按照肝臟再灌注后3h，6h，12h，24 h各時點每次處死5只大鼠。從IVC穿刺采集血標本4ml后注入血生化管中，室溫血液自然凝固后離心，取上層血清標本凍存于-20℃?zhèn)溆谩Ｇ腥〈笫蟾沃腥~部分作為標本檢測，分別置液氮凍存和10

13、％中性甲醛固定備用。
　　 4.觀察指標血清酶學變化，病理形態(tài)學改變以及細胞凋亡指數(shù)。
　　 5.統(tǒng)計學分析計量資料用均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組均數(shù)間比較采用析因設(shè)計的方差分析，組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(LSD-t)，若方差不齊，采用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.血清酶學指標變化血清標本在再灌注

14、后3h，6h，12 h及24 h各時間點取材，比較同一時間點血清ALT、AST及LDH水平差異。在同一時間點，各組動物血清中AST水平，差異無統(tǒng)計學意義（未標明具體數(shù)據(jù)）。但是血清ALT、LDH的變化差異，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。大鼠經(jīng)自體肝移植手術(shù)后，I/R組和rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)的血清ALT、LDH水平均較假手術(shù)組(Sham)顯著升高(P＜0.01)。I/R+rHuEPO組同I/R組比較，血清中ALT、

15、LDH水平均顯著降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后，血清ALT、LDH水平在再灌注后3h內(nèi)迅速上升，于再灌注后6 h噠到較高水平后呈下降趨勢，但至再灌注后24 h為止，血清中ALT、LDH水平均未恢復(fù)至正常水平，同Sham組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2.組織形態(tài)學變化選取再灌注6h后的肝臟標本，作為觀察對象。HE染色結(jié)果提示:假手術(shù)組(Sham)大鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝

16、竇排列整齊，未見中性粒細胞浸潤。大鼠經(jīng)歷缺血再灌注損傷后6h，I/R組肝細胞腫脹，肝細胞邊界不清，肝小葉中央靜脈和肝血竇淤血明顯，肝血竇狹窄，肝細胞索排列紊亂，肝細胞可見不同程度的水腫變性和空泡狀變性，偶可見點狀壞死，肝組織中有明顯中性粒細胞的聚集、浸潤，以中央靜脈周圍為甚。同Sham組比較，I/R組病理形態(tài)學評分高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但是，經(jīng)rHuEPO預(yù)處理的肝臟(I/R+rHuEPO)組織，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小

17、葉中央靜脈、肝細胞索、肝血竇結(jié)構(gòu)清晰，細胞變性不明顯，中性粒細胞浸潤減輕。
　　 3.肝細胞凋亡情況TUNEL法檢測提示:肝臟缺血再灌注時組大鼠肝臟可見凋亡細胞。檢測結(jié)果表明:缺血再灌注組(I/R)和I/R+rHuPO預(yù)處理組TUNEL陽性細胞較Sham組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);I/R+rHuPO預(yù)處理組TUNEL陽性細胞顯著低于I/R組(P＜0.05);Sham組偶見陽性細胞。
　　 小結(jié)：

18、>　　 本部分以SD大鼠為實驗動物，運用大鼠自體肝移植模型模擬肝臟缺血再灌注損傷。通過檢測血清酶學指標、組織病理學及細胞凋亡指數(shù)的變化證實了該模型能夠反應(yīng)缺血再灌注損傷的病理生理過程。rHuEPO預(yù)處理能夠降低血清酶學指標，改善肝臟組織形態(tài)，具有減輕缺血再灌注導(dǎo)致的損傷，對大鼠肝臟缺血再灌注損傷有保護作用。
　　 第三部分、PI3K/AKT信號通路在rHuEPO預(yù)處理對大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷保護中的作用
　　 目

19、的：在第二部分實驗的基礎(chǔ)上，實驗擬利用大鼠自體肝移植的模型及PI3K特異性抑制劑LY294002，通過檢測血清酶學指標的變化，肝臟病理形態(tài)改變和AKT蛋白的激活情況，探討PI3K/AKT信號通路是否參與rHuEPO預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。
　　 方法：
　　 1.自體肝移植動物模型的建立（同第一部分）。
　　 2.實驗動物①GroupⅠ: Sham組;②GroupⅡ:缺血再灌注組(I/R);③Gro

20、upⅢ: rHuEPO預(yù)處理組（I/R+rHuEPO），上述三組第二部分實驗已完成，本部分一并納入分析。本部分實驗采用60只SD大鼠，隨機分入下列組別:④GroupⅣ: I/R+DMSO組(20只)，術(shù)前30 min，經(jīng)尾靜脈給予1ml2％(v/v)DMSO;⑤GroupⅤ: I/R+LY294002組（20只），術(shù)前60 min，按照1 mg/kg的LY294002將其溶解于1ml2％(v/v) DMSO中經(jīng)尾靜脈給藥;⑥GroupⅥ

21、:I/R+rHuEPO+LY294002組(20只)，術(shù)前60 min，按照1 mg/kg的LY294002將其溶解于0.5 ml2％(v/v) DMSO中經(jīng)尾靜脈給藥，術(shù)前30 min再按照體重(Kg)×3000U/kg rHuEPO并將混合在0.5ml的0.9％ NS中，經(jīng)尾靜脈再次給藥。上述各組動物，均行自體肝移植手術(shù)。
　　 3.標本的采集和保存（同第二部分實驗）。
　　 4.觀察血清酶學的指標檢查，肝臟組織形態(tài)

22、學評分（同第二部分實驗）。
　　 5.Western Blot檢測rHuEPO和LY294002單獨及聯(lián)合預(yù)處理對總AKT和磷酸化AKTSer473蛋白表達的影響。
　　 6.統(tǒng)計學分析分析方法（同第二部分實驗）。
　　 結(jié)果：
　　 1.PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理組對肝臟酶學指標的影響在肝臟再灌注（無肝期結(jié)束開始計時）3h，6h，12 h及24 h各時間點，I/R組，I/R+LY2940002

23、組，Sham組，I/R+DMSO血清ALT、LDH水平均有差異，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。自體肝移植大鼠在經(jīng)歷缺血再灌注損傷后，其血清中ALT、LDH均較Sham組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。其中I/R+DMSO組同I/組比較，結(jié)果顯示兩組SD大鼠在經(jīng)歷肝臟缺血再灌注損傷后，其血清中ALT、LDH的變化均無顯著的統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。但是I/R+LY294002組，血清ALT、LDH水平在肝臟再灌注后上述時間

24、點較I/組和I/R+DMSO組均顯著升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，I/R+LY294002組SD大鼠經(jīng)歷缺血再灌注后，血清ALT、LDH水平在再灌注后3h內(nèi)迅速上升，其后上升趨勢變緩，血清ALT、LDH水平于再灌注后6 h噠到較高水平后逐漸下降，但至再灌注24 h為止，血清ALT、LDH水平均未恢復(fù)至正常水平，同Sham組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 2.藥物預(yù)處理對肝臟組織形態(tài)學的影響為了進

25、一步觀察PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理對肝臟缺血再灌注的作用，我們對復(fù)灌后6h各組大鼠肝臟的組織形態(tài)學變化進行量化比較。再灌注后6h，在I/R+DMSO組，肝細胞腫脹，肝竇內(nèi)淤血及少量炎性細胞浸潤。LY294002預(yù)處理組(I/R+LY294002)大鼠病理學檢查可見肝細胞索結(jié)構(gòu)明顯破壞、大量的肝細胞變性、溶解，其病理損傷評分較高。在灌注后6h，同I/R+DMSO組，I/R+LY294002+rHuEPO組比較，I/R+LY294

26、002組組織病理學評分高，差異具有統(tǒng)計學意義。但LY294002+rHuEPO聯(lián)合預(yù)處理的SD大鼠，灌注結(jié)束后6h，少量壞死肝細胞形態(tài)不可辨別，細胞崩解、壞死，細胞核分解。綜合分析實驗各組(Sham、I/R、I/R+DMSO、I/R+LY29400、I/R+rHuEPO、I/R+LY294002+rHuEPO)的組織病理學染色結(jié)果:在肝臟灌注結(jié)束后6h，使用LY294002預(yù)處理，反而加重了肝臟缺血再灌注后肝臟組織結(jié)構(gòu)的破壞，而聯(lián)合使用

27、rHuEPO預(yù)處理后，肝臟病理損傷有所減輕。rHuEPO預(yù)處理組病理損傷評分低，提示其對肝臟的組織形態(tài)有保護作用。
　　 3.rHuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理對肝缺血再灌注損傷的影響在實驗設(shè)計中，將rHuEPO和LY294002聯(lián)合使用對自體肝移植大鼠進行預(yù)處理。研究發(fā)現(xiàn)在再灌注后同一時點，I/R+rHuEPO+LY294002組同I/R+rHuEPO組比較，血清ALT、LDH水平顯著升高，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.0

28、5)。但是IR+rHuEPO+LY294002組與I/R+LY294002組比較時，發(fā)現(xiàn)血清ALT、LDH水平在HuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理組有所降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.藥物預(yù)處理對總AKT和磷酸化AKTser473蛋白表達的影響以相應(yīng)蛋白條帶平均光強度值來表示AKT和p-AKT活化水平的相對強度。通過p-AKT ser473/β-actin和AKT/β-actin平均光強度值的比值，反映

29、PI3K/AKT信號通路的活化情況。肝臟灌注結(jié)束后6h，Sham、I/R、I/R+DMSO、I/R+LY29400、I/R+rHuEPO、I/R+LY294002+rHuEPO，各組總AKT表達的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。但是各組磷酸化AKTser473和總AKT(p-AKTser473/AKT)進行比較，發(fā)現(xiàn)肝臟經(jīng)歷缺血再灌注損傷后，p-AKTser473磷酸化水平增高，同sham組比較，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

30、與I/R組比較，rHuEPO預(yù)處理組磷酸化AKTser473的增高有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。LY294002預(yù)處理組同I/R組比較，其磷酸化的AKTser473水平，顯著降低，提示LY294002預(yù)處理能夠抑制缺血再灌注以及rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)肝組織中的磷酸化AKTser473蛋白增高。
　　 小結(jié)：
　　 1.通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)磷酸化AKT ser473表達增加與rHuEPO預(yù)處理引起

31、的組織病理學損傷，肝臟酶學的釋放顯著減少相一致。
　　 2.P13K阻斷劑LY294002顯著抑制了rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)磷酸化AKTser473表達的增加和對肝臟的保護。rHuEPO聯(lián)合LY294002預(yù)處理，能減輕LY294002預(yù)處理對肝臟缺血再灌注的損傷。
　　 3.進一步支持P13K/AKT信號通路的激活介導(dǎo)了rHuEPO預(yù)處理的肝臟保護作用。肝臟組織中磷酸化AKTser473、總AKT的蛋白表達的變化證實了r

32、HuEPO預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用有PI3K/AKT細胞信號通路參與。
　　 第四部分、eNOS在rHuEPO預(yù)處理對大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷保護中的作用
　　 目的：本部分實驗通過檢測肝臟組織標本中總eNOS、磷酸化eNOS Ser1177的蛋白表達，eNOS mRNA、EPOR mRNA的變化，以及血清中NO和ET-1含量變化，探討PI3K/AKT/eNOS細胞信號通路參與rHuEPO預(yù)處理對肝臟缺血

33、再灌注損傷的保護的作用機制。
　　 方法：
　　 1.收集肝臟組織標本和血清樣本（第二、三部分實驗保存）。
　　 2.實時熒光定量PCR檢測eNOS mRNA，EPOR mRNA表達。
　　 3.Western Blot檢測肝臟組織中總eNOS和p-eNOS Ser1177的蛋白表達。
　　 4.硝酸鹽還原酶法測定大鼠血清樣本中NO含量。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清樣本中ET-1

34、含量。
　　 6.統(tǒng)計學分析分析方法（同第二部分實驗）。
　　 結(jié)果：
　　 1.rHuEPO預(yù)處理對肝臟組織中eNOS mRNA含量的影響肝臟再灌注后6h，與假手術(shù)組(Sham)比較，經(jīng)歷缺血再灌注損傷各組肝臟組織內(nèi)eNOS mRNA含量顯著增高，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同其I/R，I/R+DMSO和I/R+LY294002組比較，I/R+rHuEPO預(yù)處理組肝臟組織內(nèi)eNOSmRNA含量顯著增高

35、，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但是肝臟組織內(nèi)eNOSmRNA含量在I/R+rHuEPO和I/R+LY294002+rHuEPO組，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理對肝臟組織中EROPmRNA含量的影響實時熒光定量PCR結(jié)果提示:與假手術(shù)組(Sham)比較，缺血再灌注6h后的肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA均顯著升高，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示缺血再灌注能夠增加肝臟組織中EPOR

36、 mRNA含量。同各組缺血再灌注比較，rHuEPO預(yù)處理組(I/R+rHuEPO)并不能增加肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA含量。使用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理亦不能增加或減少肝臟組織內(nèi)EPOR mRNA含量。
　　 3.藥物預(yù)處理對總eNOS，磷酸化eNOS Ser1177蛋白表達的影響通過免疫印跡分析比較缺血再灌注6h后的肝臟組織中eNOS蛋白和p-eNOSSer1177的變化，以各組磷酸化eNOS Ser1177/β

37、-actin與總eNOS/β-actin的比值進行比較。研究發(fā)現(xiàn)各組間總eNOS蛋白表達的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。磷酸化eNOS Ser1177在假手術(shù)組(Sham)中有較少的表達。但同I/R組比較，在rHuEPO預(yù)處理組使肝臟磷酸化eNOS Ser1177增加，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但是在使用PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理，磷酸化eNOS Ser1177的表達并沒有增加。聯(lián)合使用rHuEPO和LY

38、294002預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，rHuEPO預(yù)處理能改善LY294002對p-eNOS Ser1177的抑制。p-eNOS Ser1177在缺血再灌注各組中的變化趨勢同AKT及磷酸化AKTser473的趨勢一致。rHuEPO預(yù)處理能夠激活肝臟組織中磷酸化的AKT ser473和eNOS Ser1177蛋白表達增加。
　　 4.rHuEPO預(yù)處理對大鼠血清中NO含量的影響用硝酸酶還原法進行檢查肝臟灌注后3h，6h，12h，24 h血清樣本

39、中NO含量的變化。與假手術(shù)組(Sham)比較，經(jīng)歷缺血再灌注各組血清內(nèi)NO含量減少，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在同一時間點，rHuEPO預(yù)處理組血清中NO含量顯著增加。I/R+LY294002組的血清NO含量顯著降低，同其他各組（Sham，I/R，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO）比較差異具有統(tǒng)計學意義。在缺血再灌注6h后，經(jīng)歷缺血再灌注的各組大鼠的血清NO含量較低。這一變化趨勢與肝臟酶學指標的釋放，組織病理形態(tài)學的改

40、變相一致。隨著時間的推移，大鼠血清NO水平逐漸升高，rHuEPO預(yù)處理組的血清NO水平，在灌注24 h后，與假手術(shù)組的大鼠血清NO水平基本接近。
　　 5.rHuEPO預(yù)處理對大鼠血清中ET-1含量的影響用ELASA法進行檢查肝臟灌注后3h，6h，12 h，24 h血清樣本中ET-1含量的變化。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注損傷組血清內(nèi)ET-1含量顯著增加（P＜0.05）。在同一時間點，rHuEPO預(yù)處理組降低了血清中ET-1含量。

41、I/R+LY294002組的血清ET-1含量顯著升高，同其他各組（Sham，I/R，I/R+DMSO，I/R+rHuEPO）比較差異具有統(tǒng)計學意義。在缺血再灌注3h，經(jīng)歷缺血再灌注的各組大鼠的血清ET-1含量較高，隨著時間的推移，大鼠血清ET-1水平逐漸降低，rHuEPO預(yù)處理組的血清ET-1水平，再灌注24 h后，與假手術(shù)組血清ET-1水平基本接近。
　　 小結(jié)：
　　 1.rHuEPO預(yù)處理并不能增加肝臟組織內(nèi)EPO

42、R mRNA含量，但能增加肝臟組織內(nèi)eNOS mRNA含量。LY294002預(yù)處理組對EPOR mRNA含量無影響。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理增加肝臟組織p-eNOSser1177蛋白的表達，LY294002預(yù)處理組抑制了p-eNOSser1177蛋白的表達，與AKT及p-AKTser473的趨勢一致，提示PI3K/AKT/eNOS細胞信號通路參與了rHuEPO對肝臟缺血再灌注損傷的保護。
　　 3.當肝臟經(jīng)歷缺血再

43、灌注損傷后，其血清中NO和ET-1之間的平衡關(guān)系被破壞。rHuEPO預(yù)處理組能夠顯著增加血清NO的水平，調(diào)節(jié)血清中NO和ET-1間的平衡，證實了rHuEPO預(yù)處理通過激活p-eNOSser1177表達和增加NO的釋放，減輕肝臟缺血再灌注導(dǎo)致的損傷。
　　 結(jié)論：
　　 1.自體肝移植的動物模型，能夠模擬肝缺血再灌注損傷的病理生理過程。肝臟經(jīng)歷缺血再灌注后，血清酶學指標(ALT、LDH)顯著升高，肝組織結(jié)構(gòu)發(fā)生形態(tài)學改變，

44、肝細胞有壞死和凋亡的發(fā)生。
　　 2.rHuEPO預(yù)處理可顯著抑制肝臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致的血清中ALT、LDH水平的升高，改善肝臟組織形態(tài)學損傷，抑制肝細胞凋亡，減輕肝臟的病理損傷。
　　 3.LY294002預(yù)處理顯著抑制了rHuEPO預(yù)處理誘導(dǎo)p-AKTSer473表達的增加和對肝臟的保護。提示rHuEPO預(yù)處理可能通過激活PI3K/AKT細胞信號通路發(fā)揮對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用。
　　 4.LY294