PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮預(yù)處理對(duì)順鉑誘發(fā)的急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型的建立
　　目的：臨床中經(jīng)常出現(xiàn)藥物導(dǎo)致的急性腎損傷，原本復(fù)雜的疾病變得更加難以治療。本研究探討藥物順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷模型，及其可能的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠分別給予生理鹽水和不同濃度（10，15，20，25，30g/kg）的順鉑腹腔注射。注射后72小時(shí)收集小鼠血清，離心收集血漿檢測(cè)血清肌酐和尿素氮以評(píng)

2、估腎功能。在確定順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷最佳濃度后，給予小鼠最佳濃度的順鉑和和生理鹽水腹腔注射，分別于注射后（24，48，72，96小時(shí)）收集小鼠血清及腎臟標(biāo)本，離心收集血漿送檢驗(yàn)科檢測(cè)肌酐和尿素氮以評(píng)估腎功能。順鉑和生理鹽水注射后72小時(shí)腎臟標(biāo)本行PAS染色以觀察腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化并評(píng)分以評(píng)估腎臟損傷程度。
　　結(jié)果：隨著順鉑注射濃度的增加（0，10，15，20，25，30）mg/kg，小鼠血肌酐和尿素氮明顯增加，其肌酐和尿素氮分

3、別為（13±2，40±5，81±7，103±6，160±12，256±21）μmol/L和（11±2，15±4，28±6，55±9，75±11，80±9)mmol/L，腎功能急劇下降，甚至發(fā)生不可逆性腎損傷，引起腎衰竭。隨著時(shí)間的推移（0，24，48，72，96小時(shí)），腎臟損傷先增加，后減輕，在順鉑注射后72小時(shí)達(dá)到最大腎臟損傷，其肌酐和尿素氮分別為（13±2，15±3，50±7，160±12，110±15）μmol/L和（11±2，1

4、2±2，45±6，75±11，50±9)mmol/L。對(duì)照組相比，順鉑可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹壞死，蛋白管型形成和淋巴細(xì)胞浸潤，其損傷評(píng)分分別為（4±2）分和（0.5±0.5）分（*P<0.05）。
　　結(jié)論：順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷呈濃度依賴性，而與注射時(shí)間呈先增加，后減輕表現(xiàn)，用藥后72小時(shí)急性腎損傷最嚴(yán)重。
　　第二部分 PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮預(yù)處理對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的：探討PPA

5、R-γ激動(dòng)劑吡格列酮預(yù)處理對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷的保護(hù)作用并初步探索其可能的機(jī)制。
　　方法：體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠腹腔注射25mg/kg順鉑構(gòu)建急性腎損傷模型。在順鉑注射前3天分別給予生理鹽水(順鉑組)，吡格列酮（吡格列酮組）或吡格列酮和PPAR-γ抑制劑GW9662（GW組）灌胃預(yù)處理，每天1次，連續(xù)3天。在順鉑注射后（0，24，48，72）小時(shí)收集小鼠血清及腎臟標(biāo)本。血清檢測(cè)血肌酐與尿素氮；腎臟標(biāo)本行PA

6、S染色；免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟嗜中心粒細(xì)胞MPO的表達(dá)，ELISA檢測(cè)血清中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)促炎癥細(xì)胞因子KIM-1，TNF-α，IL-6，IL-1β的mRNA水平。
　　結(jié)果：與對(duì)照組血肌酐和尿素氮（17±5)μmol/L和(9±3)mmol/L）相比，順鉑可導(dǎo)致血肌酐和尿素升高，在72小時(shí)達(dá)到峰值分別為（160±13)μmol/L和(70±4)mmol/L（*P<0.05）

7、。與順鉑組相比，經(jīng)過吡格列酮預(yù)處理后，肌酐和尿素氮均明顯下降，分別為（45±4)μmol/L和(17±4)mmol/L(*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預(yù)處理后，肌酐和尿素氮無明顯下降，分別為（168±9)μmol/L和(76±6)mmol/L（P>0.05）。與對(duì)照組相比，其損傷評(píng)分為（0.5±0.5）分，順鉑可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹壞死、蛋白管型形成和炎癥細(xì)胞浸潤，其損傷評(píng)分為(4±2)分（*P<0.05）。與

8、順鉑組相比，經(jīng)吡格列酮預(yù)處理可以明顯降低腎小管上皮細(xì)胞腫脹，壞死、蛋白管型形成和炎癥細(xì)胞浸潤，其損傷評(píng)分為(1±1)分（*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預(yù)處理后，病理改變無明顯減輕，損傷評(píng)分為(5±1)分（P>0.05）。與對(duì)照組相比KIM-1mRNA水平(1±1)，順鉑可導(dǎo)致KIM-1表達(dá)升高，在48小時(shí)達(dá)到峰值，mRNA水平為（32±3)（*P<0.05）。與順鉑組相比，吡格列酮組KIM-1表達(dá)明顯下降，mRNA水

9、平為（17±4）（*P<0.05)，但GW組KIM-1表達(dá)無明顯下降，mRNA水平為（35±3）（P>0.05）。對(duì)照組腎組織幾乎無MPO（1±1）表達(dá)，順鉑組MPO表達(dá)顯著升高，達(dá)到（7±2）個(gè)（*P<0.05）。與順鉑組相比，經(jīng)過吡格列酮預(yù)處理后，MPO表達(dá)明顯下降（2±1）個(gè)(*P<0.05)，但給予吡格列酮和GW9662聯(lián)合預(yù)處理后，MPO表達(dá)無明顯下降，為（6±2）個(gè)（P>0.05）。與對(duì)照組腎臟促炎癥細(xì)胞因子(TNF-α，I

10、L-6和IL-1β) mRNA表達(dá)水平相比，順鉑可導(dǎo)致TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)明顯升高，在72小時(shí)達(dá)到峰值（*P<0.05）。吡格列酮組與順鉑組和GW組相比，TNF-α，IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與對(duì)照組TNF-α，IL-6和IL-1β分泌水平相比，順鉑可導(dǎo)致TNF-α，IL-6和IL-1β分泌明顯增多，在72小時(shí)達(dá)到峰值（*P<0.05）。吡格列酮組與與順鉑組和GW組相比，TNF-α

11、，IL-6和IL-1β分泌明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮預(yù)處理可顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷，而阻斷PPAR-γ后，不能改善急性腎損傷，機(jī)制上研究提示PPAR-γ激動(dòng)劑可通過減輕炎癥反應(yīng)而減輕急性腎損傷。
　　第三部分 PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮抑制炎癥反應(yīng)與促進(jìn)AMPK激活有關(guān)
　　目的：探討PPAR-γ激動(dòng)劑吡格列酮對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。
　　方法：在

12、體重為20-25g的雄性C57/BL6小鼠腹腔注射25g/kg順鉑構(gòu)建小鼠急性腎損傷模型。在順鉑注射前3天分別給予生理鹽水(順鉑組)，吡格列酮（吡格列酮組）或吡格列酮和GW9662（GW組）灌胃預(yù)處理，每天一次，連續(xù)3天。在順鉑注射后（0，24、48，72）小時(shí)收集小鼠腎臟標(biāo)本。RT-PCR檢測(cè)腎臟標(biāo)本中PPAR-γ，CD36，AMPK，SIRT1和p300 mRNA水平，western blotting檢測(cè)PPAR-γ，p-PPAR-

13、γ，AMPK，p-AMPK，SIRT1，p-p300，p300，Acep65，p-IκB-α，IκB-α，p65蛋白表達(dá)水平，SIRT1活性試劑盒檢測(cè)SIRT1活性，p300活性試劑盒檢測(cè)p300活性，免疫共沉淀檢測(cè)腎臟標(biāo)本中p300與p65，SIRT1與p65的結(jié)合。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，順鉑對(duì)PPAR-γ，p65，p300，AMPK mRNA表達(dá)無明顯影響，（P>0.05）。吡格列酮組與吡格列酮和GW組相比，PPAR-γ，

14、p65，p300，AMPK mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑可以明顯增加CD36的mRNA表達(dá)（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組CD36mRNA的表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與正常組相比，順鉑可以明顯減少SIRT1mRNA表達(dá)（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組SIRT1mRNA表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑對(duì)腎臟PPAR-γ，p65，p300，AMPK蛋白

15、表達(dá)無明顯影響（P>0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑可增高p-PPAR-γ，p-AMPK蛋白表達(dá)（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組p-PPAR-γ，p-AMPK表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑可導(dǎo)致p-p300和acep65，胞漿中的p-IκB-α與胞核中的p65蛋白表達(dá)水平明顯增高（*P<0.05）。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組p-p300和acep65，胞漿中的p-IκB-α與胞核中的p65表達(dá)減

16、少（P<0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑可導(dǎo)致SIRT1，IκB-α，胞漿中p65表達(dá)減少（*P<0.05）。與順鉑組和GW相比，吡格列酮組SIRT1，IκB-α，胞漿中p65表達(dá)增高（P<0.05）。與對(duì)照組相比，順鉑可減少SIRT1活性。與順鉑組和GW組相比，吡格列酮組SIRT1活性增加。與正常組相比，順鉑可增加p300活性，與順鉑組和GW9662組相比，吡格列酮組p300活性下降。
　　結(jié)論：吡格列酮可通過激活A(yù)MPK-SIR