PPARγ激動劑吡格列酮減輕大鼠創(chuàng)傷性腦損傷膠質(zhì)反應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)作用的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是臨床上一種嚴(yán)重的致殘性疾病,其死亡率和致殘率極高,且目前尚沒有理想的治療措施,因此研究創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)病機(jī)制及尋求有效的治療藥物和措施具有重要的理論意義和醫(yī)療價(jià)值。創(chuàng)傷性腦損傷除了原發(fā)性神經(jīng)損傷外,還可通過炎癥反應(yīng)、谷氨酸興奮性毒性作用、自由基生成和脂質(zhì)過氧化、離子失衡、細(xì)胞凋亡等多種互相關(guān)聯(lián)的病理機(jī)制導(dǎo)致腦損傷區(qū)周圍更廣泛的神經(jīng)元繼發(fā)性死亡,其中炎癥反應(yīng)是TBI后繼

2、發(fā)性神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素,是影響神經(jīng)細(xì)胞存活和功能恢復(fù)的重要因素。
　　 過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma,PPARγ)是配體激活的細(xì)胞核激素受體超家族成員轉(zhuǎn)錄因子,通過調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮重要作用。PPARγ激動劑吡格列酮(pioglitazone,pio)作為有效的噻唑烷二酮類(thiazolidinediones,TZDs)藥物,能

3、夠改善胰島素抵抗,控制血糖水平,而且沒有顯著的細(xì)胞毒性和并發(fā)癥,已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)作為2型糖尿病治療用藥。PPARγ激動劑還可通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子Nuclear factor-κB(NF-κB)、轉(zhuǎn)錄活化因子JAK-STAT信號通路來減少TNF-α,IL-1β和INF-γ等炎性細(xì)胞因子的釋放,從而減輕組織炎癥反應(yīng)。最近研究表明在急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷如腦缺血和脊髓損傷的動物模型上,TZDs類藥物即可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化、

4、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生以及許多炎癥趨化因子、細(xì)胞因子、粘附分子的釋放,同時又可促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)基因如熱休克蛋白的表達(dá),從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另有大量證據(jù)表明PPARγ在中樞神經(jīng)慢性疾病,如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,,AD),多發(fā)硬化(muliplesclerosis,MS),帕金森病(Parkinson's disease,PD)的治療中具有抗炎作用。
　　 主要研究內(nèi)容:
　　 1.吡格列酮減少TBI

5、大鼠腦皮層損傷區(qū)的體積
　　 本實(shí)驗(yàn)采用CCI方法制備大鼠左側(cè)頂葉腦皮層損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?利用Neutralred染色及大鼠皮層損傷區(qū)體積檢測的方法,觀察分析了pio對TBI大鼠損傷皮層損傷區(qū)體積的影響。實(shí)驗(yàn)分四組,即假手術(shù)組(sham組);TBI后溶劑處理組(vehicle+TBI組):TBI后同sham組給予等量溶劑;TBI后pio治療組(pio+TBI組);TBI后pio加PPARγ拮抗劑組(pio+T0070907+TBI組

6、)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組大鼠在CCI損傷后第15d腦皮層損傷區(qū)形成不同程度的空洞。腦皮層損傷區(qū)體積測定的結(jié)果顯示pio治療組大鼠TBI皮層損傷體積為2.21±0.94mm3,與TBI損傷組(5.51±2.11mm3)和pio拮抗劑組(4.54±1.72 mm3)相比均顯著減少(P＜0.05)。提示pio能夠通過PPARγ顯著減少了TBI大鼠腦皮層損傷區(qū)的體積,發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)的作用。
　　 2.吡格列酮減輕大鼠腦皮層損傷周圍區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞

7、的活化
　　 為探討吡咯列酮對TBI大鼠損傷皮層神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)作用是否通過減少小膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖活化導(dǎo)致的炎性反應(yīng)所引起,本實(shí)驗(yàn)采用OX-42免疫組化染色方法觀察了各實(shí)驗(yàn)組大鼠TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度和數(shù)量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠CCI損傷后第15d,正常對照組和其他實(shí)驗(yàn)組大鼠正常腦皮層OX-42染色較淺,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目少、分布稀疏、胞體小、突起細(xì)短;而TBI損傷組和pio拮抗劑組大鼠腦皮層損傷周圍區(qū)OX-42蛋白染色明顯增強(qiáng)

8、,細(xì)胞數(shù)目增多,胞體增大,突起增粗,呈現(xiàn)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。TBI損傷組大鼠皮層損傷周圍區(qū)每個視野中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較正常對照組明顯增加(P＜0.05);pio治療組大鼠皮層損傷周圍區(qū)激活小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量比TBI損傷組和pio拮抗劑組均顯著減少(P＜0.05)。提示大鼠CCI損傷引起皮層損傷周圍區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞大量活化增殖,pio能夠減少小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,PPARγ阻斷劑可逆轉(zhuǎn)pio對小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制效應(yīng)。
　　 3

9、.吡格列酮減輕大鼠皮層損傷周圍區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)
　　 本實(shí)驗(yàn)在CCI所致大鼠TBI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?應(yīng)用GFAP免疫組化染色和計(jì)數(shù)的方法,觀察了Pio及其阻斷劑對TBI大鼠皮層損傷區(qū)周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠CCI損傷后第15d,正常對照組大鼠和其它各實(shí)驗(yàn)組健側(cè)頂葉腦皮層GFAP蛋白表達(dá)較少,星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少、分布稀疏、胞體較小、突起較細(xì),呈星芒狀;TBI損傷組和pio拮抗劑組大鼠皮層損傷周圍區(qū)GFAP蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)

10、,表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量增多,胞體增大,突起增粗,呈現(xiàn)活化狀態(tài),并且在損傷空洞的邊緣形成了明顯的膠質(zhì)瘢痕。TBI組大鼠皮層損傷周圍區(qū)每個視野激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較正常對照組明顯增加(P＜0.05),而pio治療組比TBI損傷組和pio拮抗劑組均顯著減少(P＜0.05)。提示pio可以通過PPARγ抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化,減少GFAP蛋白表達(dá)和膠質(zhì)瘢痕的形成。
　　 4.吡格列酮對大鼠腦皮層損傷周圍區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)
　　 中

11、樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動最終取決于神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能。為確定吡格列酮能夠通過抗炎作用,減少損傷皮層神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)在CCI大鼠頂葉皮層損傷動物模型的基礎(chǔ)上,利用NeuN免疫組化和細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法,研究了吡格列酮及其阻斷劑對大鼠TBI后15d皮層損傷周圍區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量變化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組大鼠神經(jīng)元排列整齊,形態(tài)正常,NeuN蛋白表達(dá)較強(qiáng);TBI損傷組大鼠皮層損傷區(qū)已形成空洞,神經(jīng)元消失,而皮層損傷周圍區(qū)Ne

12、uN蛋白表達(dá)減少,神經(jīng)元排列稀疏,胞體縮小,部分突起斷裂,殘留的神經(jīng)元萎縮,神經(jīng)元數(shù)目較正常對照組明顯減少(P＜0.05)。而pio治療組大鼠皮層損傷區(qū)周圍神經(jīng)元形態(tài)完整,NeuN蛋白表達(dá)較TBI損傷組加強(qiáng),細(xì)胞胞體呈橢圓形,突起較長。神經(jīng)元數(shù)量較TBI損傷組和pio拮抗劑組均明顯增多(P＜0.05)。提示pio可通過PPARγ促進(jìn)TBI大鼠腦皮層損傷周圍區(qū)神經(jīng)元損傷的修復(fù)和存活。
　　 5.LPS致體外培養(yǎng)新生大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)

13、胞死亡的劑量依賴性以及吡格列酮的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)
　　 為從細(xì)胞水平探討吡咯列酮的抗炎作用及其神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制,本工作利用倒置顯微鏡觀察、活細(xì)胞計(jì)數(shù)和NSE免疫細(xì)胞化學(xué)方法,觀察了不同濃度LPS溶液對體外培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的存活生長的影響以及吡咯列酮對其的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組新生鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞生長到第5d,其胞體飽滿,邊界清晰,周圍有光暈,有2-3個突起,細(xì)胞間突起形成網(wǎng)狀連接。用1μg/mL、10μg/mL、

14、20μg/mL、100μg/mL LPS溶液分別處理細(xì)胞48h,發(fā)現(xiàn)1μg/ml LPS組細(xì)胞生長狀況與對照組比較無明顯差異;10μg/mL LPS組活細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞體積縮小,突起斷裂,細(xì)胞之間突觸連接減少;100μg/mL LPS組可見大量的死亡細(xì)胞碎片,幾乎無存活的神經(jīng)細(xì)胞。10、20、100μg/ml LPS組活細(xì)胞計(jì)數(shù)與對照組比較,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,存在顯著性差異(P＜0.01)。NSE陽性神經(jīng)元免疫組化染色發(fā)現(xiàn)隨LPS溶液

15、濃度的增加神經(jīng)元數(shù)量呈濃度依賴性減少,10、20、100μg/mL LPS組神經(jīng)元數(shù)量與對照組比較,存在顯著性差異(P＜0.01)。用pio(10μmol/L)和LPS(10μg/mL)溶液共同作用于新生大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞48h后,與10μg/mL LPS組比較,活細(xì)胞計(jì)數(shù)和NSE陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(P＜0.01)。提示LPS溶液呈劑量依賴性地導(dǎo)致體外培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡,pio可以部分阻斷LPS誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)細(xì)胞

16、死亡。
　　 6.吡咯列酮減輕LPS所致的體外培養(yǎng)的新生鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡
　　 本實(shí)驗(yàn)利用Hoechst333258熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法,探討LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞死亡的性質(zhì)以及吡咯列酮的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組細(xì)胞核呈朦朧藍(lán)色熒光,而10μg/ml、20μg/ml、100μg/ml LPS溶液作用于培養(yǎng)至第五天的新生大鼠皮層細(xì)胞48h后,細(xì)胞核呈現(xiàn)亮而致密的藍(lán)色熒光,凋亡細(xì)胞

17、的數(shù)量呈LPS溶液劑量依賴性增加,與對照組比較差異非常顯著(P＜0.01)。Pio(10μmol/L)+LPS(10μg/mL)溶液組凋亡細(xì)胞的數(shù)目明顯減少,與10μg/ml LPS溶液組比較差異顯著(P＜0.01)。提示LPS可以誘導(dǎo)培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡,Pio可以部分阻斷LPS誘導(dǎo)的新生鼠大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.大鼠TBI皮層損傷后由于神經(jīng)細(xì)胞原發(fā)和繼發(fā)性損傷,在損傷區(qū)形成了空洞。P

18、io治療可以顯著減少皮層損傷體積和神經(jīng)元數(shù)目的丟失,增強(qiáng)了損傷腦組織神經(jīng)元的存活和修復(fù)作用。T0070907治療可對抗pio對腦組織的保護(hù)作用。
　　 2.大鼠TBI皮層損傷后損傷皮層周圍區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度增殖活化和膠質(zhì)瘢痕形成。Pio治療顯著減少損傷皮層周圍區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖活化,發(fā)揮抑制損傷腦組織炎性反應(yīng)的作用。T0070907治療可對抗pio抑制腦組織炎性反應(yīng)的作用。
　　 3.LPS