PPAR-γ激動劑吡格列酮抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞免疫激活致動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的研究.pdf

1、本研究分為體外研究與體內(nèi)研究二部分：
　　 體外研究：PPAR-γ激動劑吡格列酮抑制外源性血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞功能活化及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的：腎素血管緊張素系統(tǒng)在樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)上表達(dá)并具有功能活性，提示血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)可能通過調(diào)節(jié)DC功能在免疫炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。本部分體外研究過氧化物酶體增生物激活受體-γ(peroxisome

2、 protiferator activated receptor-gamma, PPAR-γ)激動劑吡格列酮(pioglitazone, Pio)對外源性AngⅡ誘導(dǎo)DC功能活化的影響，并進(jìn)一步探討其內(nèi)在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)人外周血單核細(xì)胞來源的DC，直接加入AngⅡ干預(yù)，或者經(jīng)PPAR-γ激動劑Pio預(yù)處理后再加入AngⅡ干預(yù)。然后采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測DC表達(dá)表型分子CD80、CD86、CD83和HLA

3、-DR的功能，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測DC分泌細(xì)胞因子IL-6、TNF-a和IL-12的功能，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的功能。進(jìn)一步通過蛋白印跡試驗檢測DC內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的磷酸化，電泳遷移率轉(zhuǎn)變試驗檢測DC內(nèi)核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性。
　　 結(jié)果：外源性AngⅡ的刺激能上調(diào)人

4、單核細(xì)胞來源DC表面的成熟標(biāo)記分子CD83和共刺激分子CD86，但對共刺激分子CD80和MHC-Ⅱ類分子HLA-DR的表達(dá)無顯著影響；能促進(jìn)DC分泌炎癥因子IL-6和TNF-α，但對T淋巴細(xì)胞刺激因子IL-12分泌的促進(jìn)作用不明顯；能顯著增強(qiáng)成熟DC刺激的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，但對未成熟DC刺激T淋巴細(xì)胞增值能力的增加不明顯。經(jīng)PPAR-γ激動劑Pio預(yù)處理能明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)DC上調(diào)CD83分子表達(dá)，但對AngⅡ上調(diào)CD86分子表達(dá)無

5、顯著影響；能減少AngⅡ促進(jìn)DC分泌IL-12和TNF-α，但對AngⅡ刺激IL-6分泌影響不大；Pio還能夠阻斷AngⅡ協(xié)同刺激DC激活T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外源性AngⅡ刺激人單核細(xì)胞來源DC能促進(jìn)DC內(nèi)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-related kinase, ERK)和P38 MAPK的磷酸化，但對c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)磷

6、酸化的作用不明顯；還能增強(qiáng)DC內(nèi)NF-κB/DNA結(jié)合活性。經(jīng)PPAR-γ激動劑Pio預(yù)處理能明顯抑制AngⅡ促進(jìn)DC內(nèi)ERK和P38 MAPK的磷酸化，而且還能降低AngⅡ增強(qiáng)的DC內(nèi)NF-κB/DNA結(jié)合活性。
　　 總結(jié)：PPAR-γ激動劑Pio能抑制外源性AngⅡ誘導(dǎo)DC功能活化，其內(nèi)在的分子機(jī)制至少部分是通過阻斷MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。這些研究的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實了上述多種介質(zhì)相互作用在調(diào)節(jié)DC介導(dǎo)的免疫炎

7、癥過程中具有十分重要的作用。
　　 體內(nèi)研究：PPAR-γ激動劑吡格列酮抑制內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ致ApoE基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定及其免疫炎癥機(jī)制
　　 目的：動脈粥樣硬化易損斑塊破裂是引起急性心血管事件的主要原因，但是導(dǎo)致斑塊失穩(wěn)的具體機(jī)制至今仍未完全闡明。在前面的體外研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動劑Pio能抑制外源性AngⅡ誘導(dǎo)DC功能活化，本部分實驗通過建立內(nèi)源性高AngⅡ動脈粥樣硬化小鼠模型，研究在體

8、情況下PPAR-γ激動劑Pio對內(nèi)源性AngⅡ誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的影響，并進(jìn)一步探討DC介導(dǎo)的免疫炎癥機(jī)制在動脈粥樣硬化斑塊易損中的作用。
　　 方法：在ApoE-/-小鼠的基礎(chǔ)上進(jìn)行兩腎一夾(two kidney one clip,2K1C)手術(shù)，建立內(nèi)源性高AngⅡ動脈粥樣硬化小鼠模型，另行假手術(shù)作為對照。2K1C術(shù)后小鼠分成兩組，其中一組予PPAR-γ激動劑Pio20 mg/kg/d灌胃，稱為2K

9、1C+Pio組，另一組予等量生理鹽水灌胃，稱為2K1C組；假手術(shù)小鼠也分成兩組，其中一組予Pio20 mg/kg/d灌胃，稱為sham+Pio組，另一組予等量生理鹽水灌胃，稱為sham組。各組小鼠嚴(yán)格按照實驗計劃連續(xù)處理12周，然后經(jīng)有創(chuàng)頸動脈測壓法測定動脈血壓，常規(guī)生化檢測血脂、血糖水平，放射免疫法檢測血漿腎素活性和AngⅡ濃度；主動脈弓大體照片和胸腹主動脈油紅O染色觀測主動脈斑塊負(fù)荷，主動脈根部組織切片蘇木精-伊紅染色和平滑肌細(xì)胞肌

10、動蛋白免疫組化染色評價斑塊易損性，CD3免疫組化染色T淋巴細(xì)胞，S-100蛋白和C-C家族趨化因子受體-7(C-C chemokine receptor type7, CCR7)免疫組化雙染色DC檢測斑塊內(nèi)免疫炎癥細(xì)胞的浸潤及功能狀態(tài)。
　　 結(jié)果：成功建立內(nèi)源性高AngⅡ動脈粥樣硬化小鼠模型，2K1C術(shù)后ApoE--小鼠動脈血壓顯著增高，血漿腎素活性明顯增強(qiáng)，AngⅡ濃度顯著增高；Pio藥物干預(yù)以后ApoE--小鼠動脈血壓無明

11、顯變化，雖然血漿腎素活性增強(qiáng)，但AngⅡ濃度未見明顯差異；2K1C術(shù)后和Pio藥物干預(yù)對ApoE-/-小鼠體重、心率，血脂、血糖水平均無明顯影響。2K1C術(shù)后所致的內(nèi)源性高AngⅡ能促進(jìn)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)展：主動脈弓和胸腹主動脈的斑塊負(fù)荷增加，斑塊面積增大；還能促進(jìn)斑塊易損性：斑塊脂質(zhì)核心增大，纖維帽變薄甚至破壞，斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量減少，T淋巴細(xì)胞浸潤增加。Pio藥物治療能延緩內(nèi)源性AngⅡ所致的ApoE-/-小鼠動脈粥

12、樣硬化進(jìn)展：主動脈弓和胸腹主動脈的斑塊負(fù)荷降低，斑塊面積減少；還能抑制斑塊的易損性：脂質(zhì)核心減小，纖維帽增厚并且連續(xù)完整，斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞含量增加，T淋巴細(xì)胞浸潤減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，2K1C術(shù)后所致的內(nèi)源性高AngⅡ能促進(jìn)ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)DC浸潤及功能活化：斑塊內(nèi)CCR7陽性DC含量增加，主要分布于斑塊的肩部或斑塊核心的邊緣區(qū)域，并且與T淋巴細(xì)胞聚集在一起激活斑塊內(nèi)局部免疫炎癥反應(yīng)。Pio藥物干預(yù)能抑制內(nèi)源性Ang