蘇木酮A對(duì)順鉑所致腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：蘇木酮A抗順鉑所致小鼠腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的：
　　順鉑（Cisplatin，CP）作為抗腫瘤常用的最有效化療藥物應(yīng)用之一，在治療的同時(shí)，可產(chǎn)生腎毒性損傷，影響其臨床應(yīng)用。本部分采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從整體水平上觀察蘇木酮A（Sappanone A，SA）能否逆轉(zhuǎn)或改善順鉑所致腎組織毒性損傷，并通過(guò)觀察氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的變化，探討其可能的保護(hù)機(jī)制。
　　方法：
　　將Balb/c小鼠隨機(jī)分

2、為5組（每組n=8只）。
　?、倏瞻讓?duì)照組（Control）；
　?、贑P組（20 mg/kg）；
　?、跜P+SA低劑量組（10 mg/kg）；
　　④CP+SA中劑量組（20 mg/kg）；
　?、軨P+SA高劑量組（40 mg/kg）。聯(lián)合用藥組提前3天給予蘇木酮A預(yù)處理，順鉑給藥后4天，處死動(dòng)物，留取血、腎標(biāo)本。
　　生物化學(xué)方法檢測(cè)血清中BUN和Cr的含量；HE染色光學(xué)顯微鏡觀察腎臟組織病理

3、學(xué)變化；TUNEL檢測(cè)腎組織細(xì)胞的凋亡率；生物化學(xué)方法檢測(cè)血清SOD酶活性及腎組織MDA含量；熒光定量PCR檢測(cè)腎組織中TNF-α、IL-1β、Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)。ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β蛋白水平表達(dá)，Western blot法檢測(cè)腎組織中HO-1、p-p65、 P65、IκB、p-IκB和Nrf2表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.蘇木酮A能夠改善順鉑所致的腎功能損傷：CP組小鼠血清中BUN和Cr的

4、含量均顯著高于Control組；CP+SA各劑量組小鼠血清中BUN和Cr的含量均顯著低于CP組，呈劑量依賴(lài)性（P<0.05）。
　　2.蘇木酮A能夠改善順鉑所致的腎組織損傷：CP組腎組織損傷程度嚴(yán)重，腎小管重度顆粒空泡變性，部分腎小管刷毛緣脫落，局部胞漿崩解，小管內(nèi)可見(jiàn)細(xì)胞碎片；而CP+SA組小鼠的腎組織損傷較順鉑組明顯減輕，尤以高劑量組減輕明顯。
　　3.蘇木酮A能夠降低順鉑所致腎小管上皮細(xì)胞凋亡：CP組小鼠腎小管上皮細(xì)胞

5、凋亡率顯著高于Control組（P<0.05）；CP+SA各劑量組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡率均顯著低于CP組（P<0.05）。
　　4.蘇木酮A能夠緩解順鉑所致的腎組織氧化應(yīng)激水平：與Control組比較，CP組小鼠腎組織中SOD酶活性顯著降低（P<0.05）而MDA含量顯著增加；與CP組比較，CP+SA各劑量組小鼠血清中SOD酶活性均明顯升高（P<0.05）而腎組織中MDA含量均顯著減少（P<0.05），呈劑量依賴(lài)性。
　　5.

6、蘇木酮A能夠降低順鉑所致的腎組織p-NF-κBp65的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示：CP組小鼠腎組織中p-p65、p-IκB表達(dá)顯著高于Control組（P<0.05），而IκB表達(dá)下降；當(dāng)用順鉑與蘇木酮A聯(lián)合給藥后，小鼠腎組織中p-p65、p-IκB表達(dá)顯著低于CP組、IκB表達(dá)上調(diào)（P<0.05），且隨著蘇木酮A濃度的增加，p-NF-κB表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴(lài)性。
　　6.蘇木酮A能夠降低順鉑所致的腎組織的炎癥反應(yīng)

7、：與Control相比， CP組小鼠腎組織中TNF-α、IL-1βmRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯增高（P<0.05）而 Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量則均顯著降低（P<0.05）；SA能夠逆轉(zhuǎn)CP引起的上述改變，且呈劑量依賴(lài)性。
　　小結(jié)：
　　1.蘇木酮A能夠減輕順鉑所致腎組織結(jié)構(gòu)損傷和細(xì)胞凋亡，改善腎功能。
　　2.蘇木酮A抗順鉑導(dǎo)致的腎組織細(xì)胞毒性損傷作用可能是通過(guò)提高Nrf2表達(dá)，從而調(diào)控其下游相

8、關(guān)基因而發(fā)揮抗氧化作用、抗炎癥和抗細(xì)胞凋亡作用而實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分：蘇木酮A抗順鉑所致HK-2細(xì)胞毒性作用及機(jī)制
　　目的：
　　本研究選用人腎近曲小管上皮細(xì)胞株（HK-2細(xì)胞）為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平上探討蘇木酮A（Sappanone A，SA）抗順鉑所致細(xì)胞毒性作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分3組。
　?、倏瞻讓?duì)照組（DMSO組）；
　?、陧樸K組（CP組，5μM）；

9、r>　　③蘇木酮A聯(lián)合順鉑組（5μM CP+10μM SA組、5μM CP+20μM SA組及5μM CP+30μM SA組）。
　　于CP給藥前1小時(shí)加入SA。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β蛋白水平；生化法檢測(cè)細(xì)胞中MDA、·OH蛋白含量；Western blot檢測(cè)p-p65、 P65、IκB、p-IκB和Nrf2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.SA能夠逆轉(zhuǎn)CP所致的

10、腎小管上皮細(xì)胞毒性損傷
　　MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，CP對(duì)HK-2細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒作用，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，增殖水平明顯下降；與CP組相比，經(jīng)SA預(yù)處理后，CP+SA組HK-2細(xì)胞的增殖水平顯著上調(diào)，呈劑量依賴(lài)性。
　　2.SA預(yù)處理能夠降低CP所致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與control組相比，CP組HK-2細(xì)胞凋亡率明顯增高[（38.06±2.38）％]；與單用順鉑組相比，CP+SA聯(lián)

11、合用藥組HK-2細(xì)胞凋亡百分率顯著減少[（30.65±1.21）%,(28.23±2.33)%和(20.89±3.23）%]，并隨著蘇木酮A的作用濃度增加，細(xì)胞的凋亡率隨之降低（P<0.05）。
　　3.SA預(yù)處理能夠降低CP所致腎小管上皮細(xì)胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放
　　ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：CP組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β蛋白的含量明顯高于Control組（P<0.05）；CP+10μM

12、SA、CP+20μM SA組、CP+30μM SA各聯(lián)合給藥組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β蛋白的含量均明顯低于CP組（P<0.05），且隨著蘇木酮A濃度的增高而逐漸降低。
　　4.SA能降低CP所致HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激水平
　　生化法檢測(cè)MDA、·OH含量檢測(cè)結(jié)果顯示：與Control組比較，CP組HK-2細(xì)胞中MDA、·OH含量顯著增高（P<0.05）；當(dāng)用CP與SA聯(lián)合給藥后，CP+10μM SA、CP+

13、20μM SA組、CP+30μM SA的HK-2細(xì)胞中MDA、·OH含量顯著低于CP組小鼠（P<0.05），且隨著SA給藥濃度的增加，MDA、·OH含量逐漸降低，呈劑量依賴(lài)性
　　5.SA能夠降低CP所致的腎小管上皮細(xì)胞中p-NF-κBp65蛋白表達(dá)而上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)水平
　　Western blot結(jié)果顯示：與Control比較，CP組HK-2細(xì)胞中p-p65和p-IκB蛋白的表達(dá)水平顯著增高（P<0.05）；CP+1

14、0μM SA、CP+20μM SA組、CP+30μM SA各聯(lián)合給藥組HK-2細(xì)胞中p-p65和p-IκB蛋白的表達(dá)水平顯著低于CP組（P<0.05），且隨著蘇木酮A給藥濃度的增加， p-p65, p-IκB蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，呈劑量依賴(lài)性。
　　與Control相比，CP組HK-2細(xì)胞中Nrf2核蛋白相對(duì)表達(dá)量則顯著降低（P<0.05）；SA能夠逆轉(zhuǎn)CP引起的上述改變，且呈劑量依賴(lài)性。
　　小結(jié):蘇木酮A具有抗順鉑所致

15、HK-2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，其作用可能與提高核蛋白Nrf2的表達(dá)、降低NF-κB活化從而抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　第三部分：Nrf2信號(hào)通路在蘇木酮A抗順鉑所致HK-2細(xì)胞毒性中的作用
　　目的：
　　Nrf2/ARE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為人類(lèi)機(jī)體內(nèi)最為重要的內(nèi)源性防御體系，在抗氧化應(yīng)激、抗炎反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡和抗組織器官損傷保護(hù)等方面發(fā)揮重要作用。本部分在前兩部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，敲低Nrf2表達(dá)后，觀察SA和順

16、鉑聯(lián)合用藥的HK-2細(xì)胞細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、NF-κB活性及IL-1β釋放的變化，深入探討Nrf2信號(hào)通路在SA抗CP所致腎小管上皮細(xì)胞損傷中的確切作用。
　　方法：將含有Nrf2 siRNA的片段克隆入慢病毒載體Pglv3-GFP中，隨后將該載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝出含有Nrf2 siRNA的病毒并將之感染HK-2細(xì)胞，構(gòu)建Nrf2沉默表達(dá)的HK-2細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為8組（n=3）：
　?。?）正常對(duì)照組（NC組）；

17、>　　（2）CP組；
　　（3）SA組；
　?。?）CP+SA組；
　?。?）Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組；
　?。?）CP+Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組；
　?。?）SA+Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組；
　　（8）CP+SA+Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染組。
　　流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；比色法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)（·OH、MDA含量）；western blot法檢測(cè)細(xì)胞中HO-1、Nr

18、f2和p-p65蛋白表達(dá)；ELISA技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-1β含量。
　　結(jié)果：
　　1.下調(diào)Nrf2表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)SA對(duì)抗CP致HK-2細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用：流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL結(jié)果顯示，CP能夠誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞
　　凋亡，而SA能夠逆轉(zhuǎn)CP所致細(xì)胞凋亡，但敲低Nrf2表達(dá)后SA并不能逆轉(zhuǎn)CP所致的HK-2細(xì)胞凋亡，腎小管上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高；
　　2.下調(diào)Nrf2表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)SA對(duì)CP致HK-2細(xì)胞

19、氧化應(yīng)激反應(yīng)的保護(hù)作用：
　　與正常對(duì)照組相比，CP組細(xì)胞中·OH和MDA含量均明顯增加（P<0.05）；與CP組相比，SA+CP組細(xì)胞中·OH和MDA含量均明顯減少（P<0.05）；敲低Nrf2基因的SA+CP組HK-2細(xì)胞中·OH和MDA含量增加（P<0.05）。
　　3.下調(diào)Nrf2表達(dá)能夠降低SA和CP聯(lián)合用藥組中HO-1蛋白的表達(dá)：
　　Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與非

20、轉(zhuǎn)染各組（對(duì)照組）相比，敲低Nrf2基因的各組HK-2細(xì)胞中HO-1的蛋白表達(dá)均明顯降低，（P<0.05）；尤其是與CP組相比，CP+siRNA組HO-1蛋白表達(dá)顯著降低；與CP+SA組相比，CP+SA+siRNA組HO-1蛋白表達(dá)更低；
　　4.下調(diào)Nrf2表達(dá)能夠上調(diào)SA和CP聯(lián)合用藥組中p-NF-κBp65蛋白表達(dá)：
　　CP能夠上調(diào)HK-2細(xì)胞中p-NF-κBp65蛋白表達(dá)，而SA能夠降低CP介導(dǎo)的p-NF-κBp6

21、5表達(dá)；與CP+SA組相比，CP+SA+siRNA組中p-NF-κBp65蛋白顯著上調(diào)；
　　5.下調(diào)Nrf2表達(dá)能夠上調(diào)SA和CP聯(lián)合用藥組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量：
　　ELISA結(jié)果顯示，與CP組，CP+siRNA組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量顯著增多，CP+SA組反而降低；而與CP+SA組相比，CP+SA+siRNA組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β含量卻顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

22、小結(jié)：
　　1.敲低HK-2細(xì)胞中Nrf2表達(dá)能夠上調(diào)HK-2細(xì)胞的凋亡率，加重CP誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)SA對(duì)抗CP致HK-2細(xì)胞損傷，提示SA通過(guò)激活Nrf2，對(duì)抗CP所致的HK-2細(xì)胞凋亡的發(fā)生具有減輕細(xì)胞毒性的作用。
　　2.敲低Nrf2蛋白后，HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，提示SA減輕CP細(xì)胞毒性作用可能通過(guò)上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，從而增加HO-1蛋白表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激、降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　

23、　3.敲低Nrf2蛋白表達(dá)，能夠促進(jìn)p-p65蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外IL-1β的釋放，提示SA可能通過(guò)激活Nrf信號(hào)通路，抑制NF-kB的活化，抑制炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗CP介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的損傷。
　　結(jié)論:
　　1.蘇木酮A能夠逆轉(zhuǎn)順鉑所致的腎損傷，可能與改善炎癥反應(yīng)和／或氧化應(yīng)激，從而降低腎小管上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　2.蘇木酮A通過(guò)上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，從而增加HO-1蛋白表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激；抑制NF-