射波刀照射家兔致急性放射性肝損傷相關分子機制的初步研究.pdf

1、第一部分射波刀照射致家兔急性放射性肝損傷模型的建立
　　研究目的:探討利用射波刀單次大劑量照射家兔肝臟，建立急性放射性肝損傷模型的可行性，以及評估在射波刀照射前經(jīng)超聲引導下金標植入術的安全性及成功率。材料與方法:在ALOKA prosound F75超聲診斷儀高頻探頭的實時引導下，對20只前期肝區(qū)成功備皮后家兔的肝右外葉實施金標植入操作，并對金標位置符合射波刀照射要求的家兔行單次20Gy的虛擬靶區(qū)照射，在照射后第3天和第14天分兩

2、批處死家兔，同時對照射區(qū)和未照射區(qū)肝組織分別取材、HE染色及電鏡檢查。觀察家兔金標植入后穿刺并發(fā)癥的有無及其嚴重程度，家兔的一般生理情況（體重、毛發(fā)、精神狀態(tài)、飲水飲食量）等，評估超聲引導下金標植入的安全性;通過CT掃描明確金標的在位情況，計算金標植入的成功率;通過對受照肝組織和正常肝組織病理切片的觀察來確定受照組織是否存在放射性肝損傷。結果:18只家兔經(jīng)超聲引導金標植入成功，2只家兔因金標滑脫而失敗。一周后的CT定位發(fā)現(xiàn)，18只家兔中

3、有2只家兔的金標發(fā)生移位，故滿足射波刀照射要求的家兔總數(shù)為16只，金標植入成功率為80％(16/20)。從金標植入到最終處死期間，無家兔死亡，亦未見任何相關穿刺并發(fā)癥。家兔的體重、精神狀態(tài)、飲水飲食量、毛發(fā)、照射部位皮膚等觀察指標均未見明顯改變。照射后第3天處死的家兔肝組織HE染色未見明顯改變，但電鏡下出現(xiàn)了放射性肝損傷的細胞亞顯微結構的改變:細胞核皺縮、染色質邊集等;第14天處死的家兔在光鏡和電鏡下均出現(xiàn)了典型的放射性肝損傷改變。結論

4、:1、超聲引導下的家兔肝臟穿刺金標植入術安全、可行、成功率較高。2、單次20Gy劑量的射波刀立體定向照射家兔局部肝臟可成功建立家兔放射性肝損傷模型。
　　第二部分:蛋白質組學篩選家兔放射性肝損傷的致病機制中差異表達的蛋白質
　　研究目的:利用非標記定量蛋白質組學方法來研究家兔正常肝臟組織和受射波刀照射后出現(xiàn)急性放射性肝損傷的組織之間的差異表達的蛋白質，進而尋找與放射性肝損傷發(fā)生發(fā)展相關的蛋白分子，初步探索放射性肝損傷的致病機

5、制。
　　材料與方法:收集第一部分實驗中射波刀照射3天后處死的家兔的受照肝組織和未受照肝組織，隨機選取3只家兔的6個組織樣本。提取所有樣本的蛋白，并Bradford定量、酶解、脫鹽，使用2D-Nano-LC-ESI-MS/MS對肽段進行分析。得到的串級譜圖通過SEQUEST搜索引擎進行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫為Swiss-Prot兔種屬數(shù)據(jù)庫。將鑒定出的定量差異超過2.0倍、可重復性好的蛋白進行數(shù)據(jù)庫檢索和KEGG分析。提取6個樣本的R

6、NA，用Real time PCR驗證前面蛋白組學的結果。對所有差異表達的蛋白做GO分析、COG注釋、KEGG Pathway代謝通路注釋和富集分析，最終對檢測到的蛋白進行相互作用蛋白質組的預測，以進一步了解差異表達蛋白質的功能。
　　結果:共有338個蛋白質在急性放射性肝損傷的肝組織和非照射野肝組織中差異表達，其中表達上調217個，表達下調121個。上調倍數(shù)較大的蛋白包括USP47、POLR2A、CSTB等，下調倍數(shù)較大的蛋白包

7、括MCFD2、CAP1、CSNK2A1等。這些差異表達的蛋白的mRNA的表達變化與蛋白質組學鑒定結果一致。所有差異表達的蛋白的GO分析、COG注釋、KEGG Pathway代謝通路注釋等顯示:17.84％的差異表達的蛋白屬于胞內蛋白，17.83％屬于細胞骨架構成蛋白;47.66％參與蛋白質間的結合，29.58％參與細胞代謝;11.98％蛋白質參與細胞內進程，10.88％參與代謝進程。這些差異表達的蛋白主要的功能包括:一般的預測功能、翻譯

8、后修飾和蛋白質伴侶功能、產(chǎn)能和能量轉換功能、脂質的轉運及代謝相關的功能等。上調的蛋白質主要參與的通路或機制為補體和凝血機制、VEGF通路、MAPK通路、mTOR通路、核苷酸切除修復等，下調蛋白質主要參與的通路或機制為脂肪細胞因子信號通路、色氨酸代謝、氨基糖和核苷糖代謝、趨化因子通路、PPAR通路等。所有差異表達的蛋白的相互作用蛋白質組的預測分析提示:在照射野組與非照射野組差異表達的蛋白的編碼基因中，度最高的基因為POLR2A。