射波刀照射家兔致急性放射性肝損傷相關(guān)分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分射波刀照射致家兔急性放射性肝損傷模型的建立
　　研究目的:探討利用射波刀單次大劑量照射家兔肝臟，建立急性放射性肝損傷模型的可行性，以及評(píng)估在射波刀照射前經(jīng)超聲引導(dǎo)下金標(biāo)植入術(shù)的安全性及成功率。材料與方法:在ALOKA prosound F75超聲診斷儀高頻探頭的實(shí)時(shí)引導(dǎo)下，對(duì)20只前期肝區(qū)成功備皮后家兔的肝右外葉實(shí)施金標(biāo)植入操作，并對(duì)金標(biāo)位置符合射波刀照射要求的家兔行單次20Gy的虛擬靶區(qū)照射，在照射后第3天和第14天分兩

2、批處死家兔，同時(shí)對(duì)照射區(qū)和未照射區(qū)肝組織分別取材、HE染色及電鏡檢查。觀察家兔金標(biāo)植入后穿刺并發(fā)癥的有無及其嚴(yán)重程度，家兔的一般生理情況（體重、毛發(fā)、精神狀態(tài)、飲水飲食量）等，評(píng)估超聲引導(dǎo)下金標(biāo)植入的安全性;通過CT掃描明確金標(biāo)的在位情況，計(jì)算金標(biāo)植入的成功率;通過對(duì)受照肝組織和正常肝組織病理切片的觀察來確定受照組織是否存在放射性肝損傷。結(jié)果:18只家兔經(jīng)超聲引導(dǎo)金標(biāo)植入成功，2只家兔因金標(biāo)滑脫而失敗。一周后的CT定位發(fā)現(xiàn)，18只家兔中

3、有2只家兔的金標(biāo)發(fā)生移位，故滿足射波刀照射要求的家兔總數(shù)為16只，金標(biāo)植入成功率為80％(16/20)。從金標(biāo)植入到最終處死期間，無家兔死亡，亦未見任何相關(guān)穿刺并發(fā)癥。家兔的體重、精神狀態(tài)、飲水飲食量、毛發(fā)、照射部位皮膚等觀察指標(biāo)均未見明顯改變。照射后第3天處死的家兔肝組織HE染色未見明顯改變，但電鏡下出現(xiàn)了放射性肝損傷的細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的改變:細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)邊集等;第14天處死的家兔在光鏡和電鏡下均出現(xiàn)了典型的放射性肝損傷改變。結(jié)論

4、:1、超聲引導(dǎo)下的家兔肝臟穿刺金標(biāo)植入術(shù)安全、可行、成功率較高。2、單次20Gy劑量的射波刀立體定向照射家兔局部肝臟可成功建立家兔放射性肝損傷模型。
　　第二部分:蛋白質(zhì)組學(xué)篩選家兔放射性肝損傷的致病機(jī)制中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)
　　研究目的:利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法來研究家兔正常肝臟組織和受射波刀照射后出現(xiàn)急性放射性肝損傷的組織之間的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而尋找與放射性肝損傷發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白分子，初步探索放射性肝損傷的致病機(jī)

5、制。
　　材料與方法:收集第一部分實(shí)驗(yàn)中射波刀照射3天后處死的家兔的受照肝組織和未受照肝組織，隨機(jī)選取3只家兔的6個(gè)組織樣本。提取所有樣本的蛋白，并Bradford定量、酶解、脫鹽，使用2D-Nano-LC-ESI-MS/MS對(duì)肽段進(jìn)行分析。得到的串級(jí)譜圖通過SEQUEST搜索引擎進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)為Swiss-Prot兔種屬數(shù)據(jù)庫(kù)。將鑒定出的定量差異超過2.0倍、可重復(fù)性好的蛋白進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和KEGG分析。提取6個(gè)樣本的R

6、NA，用Real time PCR驗(yàn)證前面蛋白組學(xué)的結(jié)果。對(duì)所有差異表達(dá)的蛋白做GO分析、COG注釋、KEGG Pathway代謝通路注釋和富集分析，最終對(duì)檢測(cè)到的蛋白進(jìn)行相互作用蛋白質(zhì)組的預(yù)測(cè)，以進(jìn)一步了解差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能。
　　結(jié)果:共有338個(gè)蛋白質(zhì)在急性放射性肝損傷的肝組織和非照射野肝組織中差異表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)217個(gè)，表達(dá)下調(diào)121個(gè)。上調(diào)倍數(shù)較大的蛋白包括USP47、POLR2A、CSTB等，下調(diào)倍數(shù)較大的蛋白包

7、括MCFD2、CAP1、CSNK2A1等。這些差異表達(dá)的蛋白的mRNA的表達(dá)變化與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果一致。所有差異表達(dá)的蛋白的GO分析、COG注釋、KEGG Pathway代謝通路注釋等顯示:17.84％的差異表達(dá)的蛋白屬于胞內(nèi)蛋白，17.83％屬于細(xì)胞骨架構(gòu)成蛋白;47.66％參與蛋白質(zhì)間的結(jié)合，29.58％參與細(xì)胞代謝;11.98％蛋白質(zhì)參與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程，10.88％參與代謝進(jìn)程。這些差異表達(dá)的蛋白主要的功能包括:一般的預(yù)測(cè)功能、翻譯

8、后修飾和蛋白質(zhì)伴侶功能、產(chǎn)能和能量轉(zhuǎn)換功能、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)的功能等。上調(diào)的蛋白質(zhì)主要參與的通路或機(jī)制為補(bǔ)體和凝血機(jī)制、VEGF通路、MAPK通路、mTOR通路、核苷酸切除修復(fù)等，下調(diào)蛋白質(zhì)主要參與的通路或機(jī)制為脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、色氨酸代謝、氨基糖和核苷糖代謝、趨化因子通路、PPAR通路等。所有差異表達(dá)的蛋白的相互作用蛋白質(zhì)組的預(yù)測(cè)分析提示:在照射野組與非照射野組差異表達(dá)的蛋白的編碼基因中，度最高的基因?yàn)镻OLR2A。