PV-殺白細胞素對THP-1巨噬細胞NF-κB信號通路及炎性因子表達的影響.pdf

1、目的:PV-殺白細胞素(Panton-Valentine Leukocidin,PVL)是由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的細胞外毒素,是主要的致病因子。PVL對人和兔的多形核白細胞(PMNs)和巨噬細胞具有高度特異性,本課題目的:1、rPVL對THP-1巨噬細胞的細胞毒性研究;2、探討rPVL對THP-1巨噬細胞NF-κB信號通路及炎性細胞因子表達的影響。
　　方法:(1)用不同濃度rPVL(1nM/L,5nM/L,10nM/L,20nM/

2、L,40nM/L和80nM/L)作用THP-1巨噬細胞1,3,6h,CCK-8實驗檢測rPVL對THP-1巨噬細胞活力的影響。(2)5nM/L,20nM/L和40nM/LrPVL作用THP-1巨噬細胞,流式細胞儀檢測細胞凋亡/壞死率。(3)分別用不同濃度的rPVL(5nM/L,20nM/L)刺激THP-1巨噬細胞,于1,3,6h收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6、IL-8和TNF-α的濃度變化。(4)20nM/LrP

3、VL刺激細胞1,3,6h后,收集細胞,提取總RNA,應用RT-PCR法檢測細胞IL-6、IL-8、TNF-α、TLR2、TLR4和CD14mRNA表達。(5)應用免疫細胞化學和Western blotting方法檢測rPVL刺激THP-1巨噬細胞NF-κB的蛋白表達。(6)NF-κB阻斷劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC)阻斷NF-κB活化,RT-PCR法和ELISA法檢測其對細胞因子表達的影響。
　　結果:(1)隨著rPVL對T

4、HP-1巨噬細胞作用的濃度和時間的增加,細胞活性進行性下降。(2)rPVL作用THP-1巨噬細胞,流式細胞儀技術定量檢測凋亡/壞死,在低濃度(5nM/L rPVL)以凋亡為主,在高濃度(40nM/L rPVL)以壞死為主,且具有時間依賴性。(3)ELISA法檢測結果表明,rPVL能誘導THP-1巨噬細胞產(chǎn)生IL-8、IL-6和TNF-α,隨著rPVL刺激濃度的增加和時間的延長,IL-8和IL-6表達增加;TNF-α的表達高峰在rPVL刺

5、激1h時,隨后逐漸降低。(4)免疫細胞化學方法檢測結果顯示:正常時,NF-κBp65蛋白在胞漿均勻分布,胞漿內(nèi)呈棕色均勻淡染,rPVL刺激后2h,NF-κBp65被激活轉(zhuǎn)入核內(nèi),染色以核明顯。Western blotting方法檢測結果表明,rPVL能直接誘導THP-1巨噬細胞迅速活化NF-κB蛋白,具有時間和濃度依賴性。(5)NF-κB阻斷劑PDTC能夠阻斷NF-κB信號通路,抑制IL-6和IL-8蛋白分泌和mRNA的表達。