dsODNs靶向封閉肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的抗炎作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：評(píng)估脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的雙鏈寡聚脫氧核苷酸（dsODNs）競(jìng)爭(zhēng)性抑制對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）中核因子-κB（NF-κB）與DNA結(jié)合活性的影響效能，確定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染dsODNs的最適濃度及最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間，驗(yàn)證dsODNs-decoy策略靶向封閉肺泡巨噬細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的可行性，并探討其抗炎作用機(jī)制。
　　方法：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取出家兔的支氣管肺組織，用溫生理鹽水灌洗提取肺泡巨噬細(xì)胞，經(jīng)提純鑒定后，分對(duì)照組、LPS刺激組、Lipofe

2、ctamine2000組和不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組，分別給予不同處理后培養(yǎng)。各組在培養(yǎng)4 h、6 h、8 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用LDH試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量，了解不同處理對(duì) AMs的毒性損害；用共聚焦激光顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)及不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組AMs中熒光分布情況；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同比例dsODNs-Lipofectamine2000組中AMs的熒光

3、強(qiáng)度及細(xì)胞攝取率確定最佳轉(zhuǎn)染條件；RT-PCR檢測(cè)dsODNs轉(zhuǎn)染后AMs中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的 mRNA表達(dá)；Western-blot檢測(cè)dsODNs-Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后AMs內(nèi)NF-κB p65亞基在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的分布情況。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)染AMs的dsODNs-Lipofectamine2000濃度比為1:5時(shí)，LDH檢測(cè)細(xì)胞毒性適中，轉(zhuǎn)染效率最佳；從熒光強(qiáng)度、細(xì)胞狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率等方

4、面綜合分析，轉(zhuǎn)染6 h為最佳時(shí)間；與LPS組比較，dsODNs-Lipofectamine2000組中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥介質(zhì)的mRNA表達(dá)均明顯被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)；Western-blot結(jié)果顯示，經(jīng)dsODNs-Lipofectamine2000處理后，AMs細(xì)胞質(zhì)中NF-κB p65亞基的表達(dá)明顯多于細(xì)胞核中。
　　結(jié)論：dsODNs-Lipofecetamine2000能在體外有效轉(zhuǎn)