靶向沉默動脈粥樣硬化患者巨噬細(xì)胞中Notch基因?qū)F-κB信號通路的影響.pdf

1、[目的]:
　　研究沉默動脈粥樣硬化(Atherosclerosis AS)患者巨噬細(xì)胞內(nèi)Notch1、Notch2、Notch3基因后其對配體DLL4、JAG1以及NF-κB通路中亞基P65、P52、IκBα表達(dá)的影響，分析它們之間的關(guān)聯(lián)性，從而探討Notch和NF-κB信號通路在AS發(fā)病過程中可能的串話方式，為AS的預(yù)防和治療提供新的理論依據(jù)。
　　[方法]:
　　1.將 AS患者外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，并經(jīng)

2、流式細(xì)胞術(shù)進行細(xì)胞鑒定。將誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞分別經(jīng)Notch1-siRNA、Notch2-siRNA、Notch3-siRNA以及NC-siRNA轉(zhuǎn)染，構(gòu)建Notch低表達(dá)的siRNA-巨噬細(xì)胞模型，并對沉默效果進行評估。
　　2.使用實時熒光定量PCR(realtime Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)和免疫印跡試驗(Western Blot)法檢測轉(zhuǎn)染后各組DLL4、JAG1、NF-κB P6

3、5、NF-κB P52、IκBα基因以及蛋白表達(dá)情況。
　　3.采用凝膠遷移率實驗(EMSA)檢測轉(zhuǎn)染組NF-κB的活性。
　　4.采用免疫熒光法和生物熒光倒置顯微鏡觀察沉默巨噬細(xì)胞中Notch基因后P65、P52亞基定位分布情況。
　　[結(jié)果]:
　　1.RT-PCR結(jié)果顯示:siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，Notch3-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch1-siRNA組中NF-κB P65、NF-

4、κB P52基因表達(dá)水平漸次降低（分別為0.709±0.007、0.557±0.031、0.114±0.014;0.853±0.061、0.822±0.077、0.519±0.035），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且較空白及陰性對照組均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.05或0.01），Noch1-siRNA組下降最顯著;而IκBα表達(dá)水平漸次升高（分別為1.811±0.172、3.253±0.169、5.295±0.433），組間差異有

5、統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并均明顯高于空白、陰性對照組（P＜0.05或0.01），也以Noch1-siRNA組變化最明顯。同時Notch1-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch3-siRNA組中DLL4、JAG1的基因表達(dá)水平（分別為0.248±0.027、0.563±0.0178、0.782±0.058;0.296±0.026、0.495±0.016、0.655±0.048）較空白及陰性對照組均出現(xiàn)明顯下降(P＜0.

6、01)，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，以轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA組下降最明顯。
　　2.Western-Blot方法檢測結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，Notch3-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch1-siRNA組中DLL4、JAG1、NF-κB P65、NF-κB P52蛋白表達(dá)水平均漸次降低，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且較空白及陰性對照組均出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05或0.01)，Noch

7、1-siRNA組下降最顯著;而IκBα蛋白表達(dá)水平漸次升高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，并均明顯高于空白、陰性對照組（P＜0.05或0.01），也以Noch1-siRNA組變化最明顯。
　　3.EMSA法檢測顯示Notch-siRNA轉(zhuǎn)染的各組巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性均明顯低于空白對照組和陰性對照組，Notch1-siRNA組活性下降最顯著。
　　4.巨噬細(xì)胞核內(nèi)P65、P52蛋白的熒光強度在Notch1-siRN

8、A組（分別為21405±929、24760±600）、Notch2-siRNA組（分別為25987±911、32764±413）、Notch3-siRNA組（分別為28074±452、44106±698）較空白對照組（57238±1059、50892±1200）以及陰性對照組（55844±1331、49700±856）均不同程度減弱(P＜0.01)，且細(xì)胞核內(nèi)熒光強度較核外更低，以Notch1-siRNA組減弱最明顯(組間比較P＜0.0

9、1)。
　　[結(jié)論]:
　　1 AS患者巨噬細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Notch1-siRNA、Notch2-siRNA以及Notch3-siRNA后，可在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)NF-κB功能亞基P65、P52的表達(dá)，上調(diào)NF-κB抑制因子IκBα的表達(dá)，抑制P65、P52蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時還降低核蛋白NF-κB的DNA結(jié)合活性，從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致NF-κB信號通路受到抑制。
　　2 AS患者巨噬細(xì)胞中Notch1基因?qū)