PDTC對(duì)暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝組織NF-κB及其調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的影響.pdf

1、目的：暴發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）是一種由多種原因引起的肝細(xì)胞急性大量壞死和嚴(yán)重肝功能損傷所致的臨床綜合征。暴發(fā)性肝衰竭具有起病急，病情進(jìn)展快，并發(fā)癥多，治療難度大，死亡率高，預(yù)后極差的特點(diǎn)，是當(dāng)前肝病研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，迄今未能完全闡明。
　　 在我國(guó)，引起FHF的病因主要是病毒性肝炎，其次是藥物和中毒等因素。目前的研究認(rèn)為，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的激活在暴發(fā)性肝衰竭的發(fā)病

2、機(jī)制中起著重要作用。其中核因子.κB（nuclear factor-κB，NF-κB）在暴發(fā)性肝衰竭炎癥反應(yīng)中的重要調(diào)控作用已被證實(shí)，NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)前炎癥因子基因表達(dá)的關(guān)鍵成分之一，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、炎性酶等的表達(dá)，在多種炎癥性疾病的炎癥部位高度活化。已有研究證實(shí)，在肝臟炎癥、纖維化、肝細(xì)胞凋亡與再生、肝臟缺血再灌注損傷等病理生理過(guò)程中均伴有NF-κB的活化，是調(diào)控肝臟病理?yè)p害重要的

3、轉(zhuǎn)錄因子。
　　 腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，在很多炎癥反應(yīng)中均有它們的活化和表達(dá)。TNF-α本身是NF-κB的激活劑，而NF-κB的活化又能促進(jìn)TNF-α的活化和釋放，形成一個(gè)惡性循環(huán)。TNF-α和NF-κB的活化皆能誘導(dǎo)iNOS，從而引起一氧化氮（nitric

4、 oxide，NO）釋放，形成級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)，促進(jìn)肝損傷和發(fā)展，從而引起肝細(xì)胞大量壞死。
　　 吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）是一種抗氧化劑，能特異性抑制NF-κB活化。但抑制NF-κB的活化對(duì)暴發(fā)性肝衰竭病情進(jìn)展的影響如何?研究甚少。本研究基于上述理論，檢測(cè)D-氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS

5、）導(dǎo)致的大鼠暴發(fā)性肝衰竭及應(yīng)用PDTC后肝組織NF-κB、TNF-α和iNOS的表達(dá)情況，分析NF-κB與肝細(xì)胞損傷程度、TNF-α、iNOS的關(guān)系，探討PDTC抑制NF-κB表達(dá)對(duì)大鼠暴發(fā)性肝衰竭炎癥損傷的影響及其分子機(jī)制，從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)NF-κB在暴發(fā)性肝衰竭炎癥損傷中的作用，為臨床如何調(diào)節(jié)NF-κB活性治療暴發(fā)性肝衰竭提供理論依據(jù)。
　　 方法：1研究對(duì)象：雄性清潔級(jí)Wistar大鼠60只，體重180-200g

6、。將大鼠隨機(jī)分為模型組30只，PDTC組30只。模型組腹腔注射D-Ga1N800mg/kg，之后立即皮內(nèi)注射LPS10μg/kg，制造暴發(fā)性肝衰竭模型。PDTC組制作FHF模型前1小時(shí)腹腔注射PDTC100mg/kg，其余同模型組。2標(biāo)本的采集和保存：分別于注藥（D-Ga1N+LPS）后2，4，8，12，24小時(shí)行股靜脈放血處死，各時(shí)間點(diǎn)取模型組6只，PDTC組6只大鼠。留取血清，放血處死后立即剖腹取肝臟，取適量肝組織經(jīng)10％中性甲醛溶

7、液固定，余經(jīng)液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?肝組織標(biāo)本采用常規(guī)HE染色：光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。4采用免疫組化S-P法，對(duì)肝組織標(biāo)本進(jìn)行NF-κB、 TNF-α和iNOS的免疫組化染色。5應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine transaminase，ALT）和總膽紅素（total bilimbin，TB）水平。6采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，EL

8、ISA）方法檢測(cè)血清中TNF-α的表達(dá)情況。7應(yīng)用硝酸還原酶法檢測(cè)血清中NO的變化。8用半定量反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction.RT-PCR）方法研究NF-κB、TNF-α和iNOS mRNA在兩組肝組織中的表達(dá)情況。9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料均以x±S表示，計(jì)數(shù)資料均采用等級(jí)表示，采用秩和檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分

9、析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩組動(dòng)物一般狀況觀察：模型組隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠一般狀況逐漸惡化，依次出現(xiàn)活動(dòng)減少，飲水減少，毛發(fā)豎立，精神萎靡，嗜睡等。PDTC組各時(shí)間點(diǎn)大鼠與模型組相比情況有所好轉(zhuǎn)，無(wú)嗜睡，昏迷等。
　　 2.兩組肝組織形態(tài)學(xué)觀察：（1）肝組織大體標(biāo)本觀察：模型組肝臟組織隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)充血、出血點(diǎn)、直至大塊淤斑及壞死，肝組織邊緣較鈍。PDTC組各時(shí)間點(diǎn)肝組織病變程度

10、較模型組輕。肝組織邊緣較銳利，質(zhì)地柔軟，隨時(shí)間延長(zhǎng)仍有彌漫性出血點(diǎn)，但無(wú)大塊淤斑及壞死。（2）肝組織HE染色：模型組隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織發(fā)生的病理改變逐漸加重，依次出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性變，凋亡小體，直至大片出血，肝細(xì)胞壞死融合，核溶解、碎裂，纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)塌陷。PDTC組大鼠肝臟病理與模型組同一時(shí)間點(diǎn)相比，炎癥壞死明顯減輕，仍可見多量凋亡小體。
　　 3.血清ALT，TB， TNF-α和NO水平變化：模型組大鼠用

11、藥后2、4、8小時(shí)，ALT及TB水平緩慢升高，在12及24小時(shí)均急劇升高（P均=0.000）。PDTC組與模型組相比均明顯降低，ALT兩組同時(shí)間點(diǎn)比較，除8小時(shí)外，其余各時(shí)間點(diǎn)均比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。TB在4、12、24小時(shí)均比模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 模型組在用藥后2小時(shí)，血清TNF-α明顯升高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸下降（x2=27.871，P=0.000）。PDTC組各時(shí)

12、間點(diǎn)與模型組相比，TNF-α的升高幅度明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 模型組在用藥后2小時(shí)起血清NO即出現(xiàn)明顯升高，12h升高最明顯，以后逐漸有所下降（x2=24.062，P=0.000）。PDTC組2、8、12小時(shí)血清NO較模型組有明顯下降，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 4.兩組肝組織NF-κB蛋白及mRNA表達(dá)變化
　　 NF-κB蛋白表達(dá)：模型組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要為肝細(xì)

13、胞，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，12小時(shí)表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，隨著肝細(xì)胞壞死的加重24小時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)減少。PDTC組8、12小時(shí)NF-κB蛋白表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 NF-κ BmRNA表達(dá)：模型組NF-κ BmRNA隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，8小時(shí)達(dá)高峰，以后逐漸下降（x2=26.307，P=0.000）。PDTC組4、8小時(shí)NF-κ BmRNA表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯

14、受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 5.兩組肝組織TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)變化
　　 TNF-α蛋白表達(dá)：模型組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要為肝細(xì)胞。隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)肝細(xì)胞胞漿陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，12小時(shí)表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，24小時(shí)表達(dá)減少（x2=19.361，P=0.000）。PDTC組4、8、12小時(shí)TNF-α蛋白表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 TNF

15、-α mRNA表達(dá)：模型組TNF-α mRNA隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，12小時(shí)升高最明顯，24小時(shí)有所下降（x2=25.385，P=0.000）。PDTC組8、12、24小時(shí)TNF-α mRNA表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 6.兩組肝組織iNOS蛋白及mRNA表達(dá)變化
　　 iNOS蛋白表達(dá)：模型組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞主要為肝細(xì)胞，隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)肝細(xì)胞胞漿陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)逐漸

16、增多，8小時(shí)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，12小時(shí)及24小時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)有所下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=22.895，P=0.000）。PDTC組4、8小時(shí)iNOS蛋白表達(dá)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 iNOSmRNA表達(dá)：模型組iNOSmRNA隨給藥時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，8小時(shí)升高最明顯，12小時(shí)及24小時(shí)逐漸下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=25.281，P=0.000）。PDTC

17、組iNOSmRNA表達(dá)4小時(shí)及8小時(shí)與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，明顯受抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 模型組及PDTC組iNOS mRNA.的表達(dá)與NF-κB mRNA呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.978和0.940，P值分別為0.004和0.017。
　　 結(jié)論：
　　 1.FNF-α、iNOS、NO在D-Ga1N+LPS誘導(dǎo)的大鼠暴發(fā)性肝衰竭肝細(xì)胞的炎癥壞死中發(fā)揮了重要的作用。
　　 2.