1893.日本沼蝦表皮蛋白基因的克隆及分析

1、||『I_川川lIlfIl__|__Jllf㈣|lJf_fl_||學(xué)睜14041830521分類母Q955河南；彳秘大誓碩士學(xué)位論文日本沼蝦表皮蛋白基因的克隆及分析學(xué)科、專業(yè)研究方向申請學(xué)位類別申請人指導(dǎo)教師生物學(xué)、生理學(xué)甲殼動物生長發(fā)育的體液調(diào)控理學(xué)碩士張宇寧黔冀教授二O一七年五月摘要甲殼動物有著堅(jiān)硬的表皮，也被稱為外骨骼，作用是維持其物種特異性形態(tài)，保護(hù)并使之與外部環(huán)境隔離。甲殼動物通過周期性脫去舊的表皮產(chǎn)生新表皮來進(jìn)行生長發(fā)育。表

2、皮主要由幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)與碳酸鈣構(gòu)成，表皮蛋白(cuticleproteins，CPs)與幾丁質(zhì)結(jié)合形成纖維骨架控制表皮的鈣化，對新表皮的形成起到極其重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，咪唑類物質(zhì)KK42能顯著縮短日本沼蝦(A如c加6m如f甜聊胛堙矽D，zP船e)幼蝦的蛻皮周期，推測CPs可能是其作用的靶分子。CPs作為主要的結(jié)構(gòu)性蛋白，理論上，其表達(dá)水平及其表達(dá)的時(shí)序性改變會影響表皮的厚度，進(jìn)而影響蛻皮周期的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組

3、測序?yàn)榛A(chǔ)，通過NCBIConservedDomainsearch篩選含chitinbind4結(jié)構(gòu)域的目標(biāo)基因，采用qImPCR技術(shù)定量研究相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)及KK42處理后基因表達(dá)的變化，分析它們與蛻皮周期之間的聯(lián)系，為闡明KK一42縮短日本沼蝦蛻皮周期的機(jī)制積累資料。將500尾體長30土05cm的日本沼蝦分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組用19510。4m01／L的KK一42溶液浸泡1min，對照組用不含KK42溶液處理。于處理后O、3、6

4、、12、24和48h，取處于C、Do2、D34和A期的尾扇、腹肢和步足表皮提取mRNA，用于后續(xù)研究。結(jié)果如下：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)CPs基因的先后順序，將篩選出的3個基因分別命名為脅C尸6、脅CP一7和脅Cp8，己在NCBIGENEBANK數(shù)據(jù)庫注冊，注冊號分別為KY399478、KY3399479和KY411918。通過測序發(fā)現(xiàn)長度分別為373bp、759bp和1183bp。經(jīng)NCBIB1astx比對，慨CP一6與端足蟲(五粥彪如口z把c

5、以，XP0180101631)相似性為70％，使用CutProtFam—Pred推測為編碼RR2家族蛋白；脅CP一7與端足蟲(局尥彪砌臼z把c口，XP0180101571)相似性為73％，推測同屬于RR2家族。脅CP一8與豌豆長管蚜(以cyr歷Ds勿矗。玎p括甜聊，XP0019508062)相似性為43％。上述3個脅C風(fēng)的轉(zhuǎn)錄水平在蛻皮周期的不同階段以及不同的表皮組織呈現(xiàn)明顯的差異。以尾扇中表達(dá)量為參照，在C期、Do一2期以及D34期，