日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)卵子和胚胎發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、精子卵子成熟后,經(jīng)過(guò)受精進(jìn)入胚胎發(fā)育階段。在這一過(guò)程中,卵子不僅將母體的遺傳物質(zhì)傳遞給予代,而且其細(xì)胞質(zhì)中儲(chǔ)存的母體效應(yīng)因子是動(dòng)物胚胎發(fā)育所需營(yíng)養(yǎng)的主要源泉。卵巢是卵子發(fā)生的場(chǎng)所,因而卵巢和胚胎的發(fā)育成為發(fā)育生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。大型十足目蝦蟹類(lèi)由于具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,其卵巢和胚胎發(fā)育研究自然成為眾多學(xué)者關(guān)注的一個(gè)熱點(diǎn)。目前,蝦蟹類(lèi)的卵巢和胚胎發(fā)育研究主要集中在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)方面,而有關(guān)發(fā)育的進(jìn)程及其相關(guān)機(jī)理的研究甚少。本研究

2、首先克隆了日本沼蝦卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育的5個(gè)相關(guān)基因,分析了這些基因的分了特征。通過(guò)研究它們?cè)诼炎影l(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)模式,探討了這些基因在日本沼蝦卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育中的作用,以期為日本沼蝦乃至甲殼類(lèi)發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供有益的借鑒。本研究主要包括以下四個(gè)部分:
　　 1、日本沼蝦Mago nashi和Tsunagi基因在卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式采用RACE技術(shù)克隆得到日本沼蝦Mago nahi和Tsunagi c

3、DNA全長(zhǎng)序列,分別命名為MnMago和MnTSu。試驗(yàn)獲得了2個(gè)MnMago基因的轉(zhuǎn)錄本,cDNA全長(zhǎng)分別是746bp和683bp,兩個(gè)序列只是在5’-非翻譯區(qū)(5’-UTR)長(zhǎng)度不同,兩者之間相差63bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)和3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)則完全相同,該ORF編碼147個(gè)氨基酸。MnMago兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的5’-UTR長(zhǎng)度不同,表明MnMago基因在日本沼蝦體內(nèi)存在不同的剪切方式。MnTsu cDNA全長(zhǎng)為847bp,

4、ORF長(zhǎng)度為486bp,編碼161個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)這兩個(gè)蛋白的序列分析發(fā)現(xiàn)它們分別含有Mago和Tsunagi蛋白相應(yīng)的功能域:Mago superfamily和RNA recognition motif(RRM)。利用蛋白重疊軟件對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行相互作用預(yù)測(cè),結(jié)果表明它們能嵌合成為一個(gè)完整的蛋白復(fù)合體,提示這兩個(gè)蛋白可能與其它模式生物一樣也以復(fù)合體的形式參與日本沼蝦發(fā)育過(guò)程。熒光定量PCR(RT-QPCR)結(jié)果表明,這兩個(gè)基因在卵巢和

5、胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式完全一致。MnMago和MnTSu基因在卵巢的增殖期表達(dá)量很低。隨著卵巢的發(fā)育,其表達(dá)量逐步升高,至次級(jí)卵黃發(fā)生期達(dá)到最高,而到了成熟期顯著下降,至恢復(fù)期又有所升高,說(shuō)明MnMago和MnTsu基因?qū)θ毡菊游r卵子的發(fā)生、成熟具有調(diào)節(jié)作用。胚胎發(fā)育過(guò)程的RT-QPCR分析表明,在胚胎發(fā)育早期MnMago和MnTsu基因的表達(dá)量處于比較平穩(wěn)的狀態(tài),至原蚤狀幼體期急劇升高,提示這兩個(gè)基因與日本沼蝦胚胎后期的形態(tài)發(fā)生緊密

6、相關(guān)。MnMago和MnTsu基因在胚胎和卵巢發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式的高度一致性,提示它們?cè)谂咛ズ吐殉舶l(fā)育過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用。成體組織的RT-QPCR結(jié)果顯示,MnMago和MnTsu基因在肌肉中表達(dá)量最高,而在精巢中的表達(dá)量很低。在肌肉中表達(dá)量高的因?yàn)榭赡苁羌〖?xì)胞處于增殖狀態(tài),與MnMago和MnTsu參與活躍mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯和核質(zhì)定位有關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明MnMago和MnTsu基因具有多樣的生物學(xué)功能,同時(shí)提示它們與日本沼蝦卵子形成緊密

7、相關(guān)。
　　 2、日本沼蝦Gustavus基因在卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)分析Gustavus是與Vasa蛋白相互作用的一種蛋白,在生殖質(zhì)的定位和生殖細(xì)胞的形成中具有重要作用。Gustavus蛋白具有SPRY和SOCS功能域,研究認(rèn)為SPRY功能域與肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+釋放調(diào)節(jié)有關(guān),而SOCS功能域與蛋白質(zhì)降解有關(guān)。本試驗(yàn)從日本沼蝦卵巢中克隆得到Gustavus cDNA序列(MnGus),序列全長(zhǎng)為1099bp,其ORF長(zhǎng)度為

8、786bp,編碼261個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)其氨基酸序列功能域分析結(jié)果顯示,日本沼蝦MnGus具有Gustavus蛋白特有的SPRY和SOCS功能域。卵巢發(fā)育的RT-QPCR分析表明,MnGus基因在卵巢發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)為先升高后降低的表達(dá)模式,至初級(jí)卵黃發(fā)生期表達(dá)量達(dá)到最高值,這提示MnGus基因參與了卵子發(fā)生過(guò)程,而與卵子的最后成熟關(guān)系不大。胚胎發(fā)育的RT-QPCR分析表明,在卵裂期有一定表達(dá)量,至囊胚期表達(dá)量下降,到原腸期又逐漸升高,一直

9、到蚤狀幼體期達(dá)到最高值,這種逐漸上調(diào)的表達(dá)模式提示MnGus基因在日本沼蝦胚胎發(fā)育后期的腹部形成中具有重要的調(diào)節(jié)作用。成體組織的RT-QPCR表明該基因在肌肉中的表達(dá)量非常高,這可能是因?yàn)镸nGus蛋白中SPRY功能域參與了肌質(zhì)網(wǎng)中Ca2+活動(dòng),并在其中起著主要的作用。
　　 3、日本沼蝦泛素化結(jié)合酶Ubc9基因的時(shí)空表達(dá)及其作用泛素(ubiquitin,Ub)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路是蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)者和終結(jié)者,控制著幾乎所有

10、動(dòng)植物的生命活動(dòng),包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制等。而泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjjugatingenzyme,E2)是泛素化過(guò)程中介導(dǎo)泛素活化酶(activating enzyme,E1)和泛索連接酶(ligase,E3)之間的關(guān)鍵酶。Ubc9是其中一種結(jié)合酶,它參與類(lèi)泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier,SUMO)途徑,這個(gè)途徑參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞周期進(jìn)程

11、。本研究克隆得到日本沼蝦Ubc9 cDNA全長(zhǎng)序列(MnUbc9),其ORF長(zhǎng)度為483bp,編碼160個(gè)氨基酸。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),MnUbc9蛋白結(jié)構(gòu)中具有泛素結(jié)合酶的UBC功能域和泛素連接酶的結(jié)合位點(diǎn)。RT-QPCR結(jié)果表明,除在血液和精巢中表達(dá)量較低外,MnUbc9基因廣泛分布于其它組織。隨著卵巢的發(fā)育,MnUbc9基因表達(dá)量逐漸增強(qiáng),至次級(jí)卵黃發(fā)生期達(dá)到最高值,而后顯著下降,這與日本沼蝦卵母細(xì)胞增殖、成熟過(guò)程是高度一致的。M

12、nUbc9基因在胚胎的卵裂期有一定的表達(dá)量,至囊胚期下降,而后又逐漸升高,到胚胎發(fā)育后期達(dá)到最高。這可能是因?yàn)殡S著胚胎體積的增大,細(xì)胞有絲分裂活動(dòng)逐漸增強(qiáng),因而MnUbc9基因表達(dá)量逐漸升高。綜上所述,結(jié)合酶MnUbc9基因通過(guò)類(lèi)泛素化修飾途徑調(diào)節(jié)著日本沼蝦的卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程。
　　 4、日本沼蝦MnvWD-Kazal基因在卵子發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)分析從日本沼蝦卵巢中克隆到一個(gè)具有von Willebrand factor D

13、 domain(vWD)和Kazal型兩種功能域的新基因,將其命名為MnvWD-Kazal。vWD功能域存在于多種蛋白中,如血漿糖蛋白、載脂蛋白、黏液素、整聯(lián)蛋白和透明帶粘附素,一般具有粘附作用。Kazal功能域是Kazal型蛋白酶抑制劑的主要結(jié)構(gòu)域。本研究獲得的日本沼蝦MnvWD-Kazal cDNA全長(zhǎng)2713bp,其ORF長(zhǎng)度為2574bp,編碼857個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MnvWD-Kazal蛋白的氨基端有一個(gè)長(zhǎng)173個(gè)氨

14、基酸的vWD功能域,在羧基端有3個(gè)Kazal功能域。RT-QPCR結(jié)果表明,MnvWD-Kazal基因在整個(gè)日本沼蝦胚胎期表達(dá)量甚微,在成體組織如腸、卵巢、心臟、胸神經(jīng)節(jié)等都有一定表達(dá)量,從卵巢的增殖期開(kāi)始MnvWD-Kazal基因的表達(dá)量穩(wěn)步上升,至次級(jí)卵黃發(fā)生期達(dá)到最高值,提示該基因參與了日本沼蝦卵細(xì)胞的成熟過(guò)程。
　　 綜上所述,本研究首次克隆得到5個(gè)與日本沼蝦卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育相關(guān)基因的cDNA全長(zhǎng),并采用RT-QPCR

15、技術(shù)研究了它們?cè)谌毡菊游r卵巢和胚胎發(fā)育過(guò)程的時(shí)空表達(dá)模式,分析了它們?cè)诎l(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能,為日本沼蝦的發(fā)育生物學(xué)提供了有價(jià)值的資料。由MnMago和MnTsu等蛋白組成的外顯子拼接復(fù)合體可以識(shí)別轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA中提前出現(xiàn)的無(wú)義終止密碼子,在轉(zhuǎn)錄的水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖活動(dòng),而MnUbc9在蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂活動(dòng)。雖然迄今尚沒(méi)有足夠的證據(jù)表明MnvWD-Kazal與日本沼蝦胚胎發(fā)育直接相關(guān),但與其它4個(gè)基因相同的是在卵

16、細(xì)胞形成和增殖過(guò)程中具有重要作用。通過(guò)對(duì)這幾個(gè)基因分子特征和RT-QPCR表達(dá)的研究,為日本沼蝦等十足類(lèi)的卵子發(fā)生、胚胎發(fā)育等生殖生理過(guò)程提供更為全面的參考資料。尤其是新基因MnvWD-Kazal的發(fā)現(xiàn)為甲殼類(lèi)卵細(xì)胞成熟的調(diào)節(jié)機(jī)理研究提供了新的契機(jī)。綜上所述,本研究為日本沼蝦胚胎發(fā)育和卵子發(fā)生分子調(diào)控機(jī)制提供了線(xiàn)索,結(jié)果可為日本沼蝦苗種種質(zhì)改良提供必備的基礎(chǔ)。同時(shí),本研究為蝦蟹類(lèi)的發(fā)育機(jī)理研究提供有益的借鑒,并進(jìn)一步豐富了蝦蟹類(lèi)的發(fā)育生