日本沼蝦卵巢表達序列標簽分析及生殖相關基因的克隆與表達.pdf

1、生殖細胞的發(fā)生是發(fā)育生物學研究的主要內容之一,卵子在卵巢中的形成更是個體發(fā)育中極其重要的時期,也是歷來備受關注的生殖生物學課題。與其它模式生物相比,十足類中關于生殖的分子機制方面的研究相對薄弱,淡水蝦類尤其突出,迄今對淡水蝦類遺傳資源的了解極為有限,NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的信息量與對蝦類相比頗為匱乏。因此,大量挖掘、獲取淡水蝦類生殖相關的基因資源,無疑具有重要的意義和潛在的應用價值。同時,一些功能保守基因的發(fā)現(xiàn),也為遺傳背景薄弱的經(jīng)濟物種

2、生殖細胞的研究帶來了契機。
　　本文以日本沼蝦為研究對象,通過構建卵巢cDNA文庫及表達序列標簽分析,鑒別了29個與生殖、發(fā)育相關的基因;隨后以日本沼蝦卵巢發(fā)育過程為主線,以獲得的表達序列標簽為基礎,結合同源克隆策略,分離獲得了7個與卵母細胞形成、成熟有關的基因,并對其序列特征和時空表達進行了系統(tǒng)地分析。研究主要包括如下四個部分:
　　1、日本沼蝦卵巢cDNA文庫的構建及生殖相關基因的鑒別為了研究日本沼蝦卵巢發(fā)育過程中儲存的

3、遺傳信息,以卵巢為材料構建了cDNA文庫,文庫重組率為82.93％,庫容量為2.9×106,插入片段大小為0.5-3kb。隨機挑取文庫中3294個克隆進行5’-3’端測序,獲得了3256條高質量的表達序列標簽（ESTs）,拼接后得到了1514條單基因簇,其中可推測功能的序列占47.5%。據(jù)序列相似性分析,發(fā)現(xiàn)了組織蛋白酶B和L、細胞周期蛋白B、周期蛋白依賴性激酶、DEAD-box家族蛋白等29個與生殖、發(fā)育相關的基因。此外,在構建的文庫

4、中還發(fā)現(xiàn)了與皮質棒形成密切相關的圍食膜因子,預測在成熟卵缺少皮質棒結構的沼蝦屬種類中,這種基因同樣存在。通過卵巢cDNA文庫的構建及ESTs分析,初步明晰了與日本沼蝦卵巢發(fā)育相關的基因,為進一步研究日本沼蝦乃至十足類的功能基因組提供了重要的基礎資料。
　　2、日本沼蝦DExD-box家族基因的分子克隆、特征分析及時空表達根據(jù)ESTs提供的信息,結合同源克隆策略,采用RACE技術成功克隆了以vasa為代表的DExD-box家族4個基

5、因的全長cDNA序列。從日本沼蝦卵巢中克隆得到的DExD-box基因Mn-vasa、Mn-p68和Putative Mn-DDX39 cDNA全長分別為2391、2174和1774bp,開放閱讀框分別為1806、1623和1299bp,編碼601、540和432個氨基酸的蛋白。其中PL10基因的RNA存在選擇性剪接,得到Mn-PL10A、Mn-PL10B兩種轉錄本,兩者cDNA全長分別為2277和2649bp,開放閱讀框分別編碼485和

6、709個氨基酸的蛋白,前者比后者在N端缺少224個氨基酸。所推測的5種蛋白均具有DExD-box家族特有的9個保守結構域和GG重復序列,并且在Q-motif上游17個氨基酸處除Mn-PL10A外都存在一高度保守的苯丙氨酸（F）。RT-PCR的研究結果表明,Mn-vasa基因僅在日本沼蝦性腺中表達,并且在卵巢發(fā)育的增殖期表達量最高,此后隨著發(fā)育進程逐漸下降,至消退期下調至最低。除Mn-vasa外,DExD-box家族的另外3個基因Mn-P

7、L10、Mn-p68、Putative Mn-DDX39在日本沼蝦組織中廣泛分布,但都表現(xiàn)出在卵巢和肝胰腺中高表達的特征。它們在卵巢發(fā)育中的表達模式基本相似,都表現(xiàn)為消退期降至最低、次級卵黃發(fā)生期上調至最高。對日本沼蝦DExD-box家族基因的研究結果表明,Mn-PL10基因的RNA存在選擇性剪接,推測其屬于通過選擇啟動子形成不同轉錄本的選擇性剪接方式;Mn-vasa、Mn-PL10、Mn-p68和PutativeMn-DDX39基因在

8、結構上高度保守,這些保守結構的存在保證了其功能的實施;Mn-vasa基因的主要作用可能體現(xiàn)在卵原細胞的形成上,而Mn-PL10、Mn-p68和Putative Mn-DDX39則可能在日本沼蝦卵母細胞的成熟過程中具有調節(jié)作用。
　　3、日本沼蝦成熟促進因子（MPF）組成亞基基因的分子克隆、特征分析及時空表達成熟促進因子（MPF）由調節(jié)亞基周期蛋白B（cyclin B）和催化亞基細胞周期蛋白依賴性激酶(p34cdc2)構成。從日本沼

9、蝦卵巢中克隆得到的Mn-cyclin B基因和Mn-Cdc2基因cDNA全長分別為2318和1639bp,開放閱讀框分別編碼398和299個氨基酸的蛋白。Mn-cyclin B具有989bp偏長的3’UTR,其中集中了包括2個多聚腺苷酸加尾信號、5個胞質聚腺苷化元件（CPEs）、1個翻譯調控元件（TCE）和1個K-box在內的多種調節(jié)元件。Mn-cyclin B蛋白具有周期蛋白B特有的破壞框、周期蛋白識別框和磷酸化位點。進一步的多序列比

10、對和同源性分析表明日本沼蝦Mn-cyclin B和斑節(jié)對蝦、日本囊對蝦、鋸緣青蟹、中華絨螯蟹cyclin B的同源性分別為69%、68%、60%和60%,系統(tǒng)進化分析證明Mn-cyclin B基因在進化上高度保守。日本沼蝦周期蛋白依賴性激酶基因高度保守,和斑節(jié)對蝦、鋸緣青蟹、中華絨螯蟹Cdc2的同源性分別為92%、91%和91%;Mn-Cdc2蛋白具有蛋白激酶特有的ATP特異結合位點、PSTAIR結構域和絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）

11、蛋白激酶活化位點;此外,第14、15和161個氨基酸殘基分別是Thr14、Tyr15和Thr161?？臻g表達的實時熒光定量PCR分析表明,Mn-cyclin B在卵巢中的表達量最高,此外在精巢、肌肉、肝胰腺、表皮和血液中都有較高的表達,而在腸中的表達極其微弱。Mn-Cdc2主要在精巢、卵巢、肝胰腺和表皮內表達,其中精巢中的表達量最高,其次是卵巢。時間表達的實時熒光定量PCR分析顯示,Mn-cyclin B轉錄本在卵巢的發(fā)育過程中呈現(xiàn)周期

12、性的波動:增殖期Mn-cyclin B基因的表達量處于一相對較高的水平,卵黃發(fā)生前期有所下降,至初級卵黃發(fā)生期開始上調,至成熟期上調至最高,此后急劇下降。Mn-Cdc2基因的表達量在除次級卵黃發(fā)生期之外的其它各期都基本一致,而在次級卵黃發(fā)生期則有所上調,但與其它各期相比沒有顯著差異。綜合所得的結果,日本沼蝦cyclin B的翻譯或轉錄后調節(jié)過程是通過CPEs、TCE和K-box等復合結構的聯(lián)合作用實施的;Mn-cyclin B和Mn-C

13、dc2蛋白的氨基酸序列高度保守,從結構上保證了其在細胞分裂中調節(jié)功能的實施,并且直接參與了卵母細胞的減數(shù)分裂,在日本沼蝦卵母細胞的成熟中起著關鍵的作用。
　　4、日本沼蝦圍食膜因子基因的分子克隆、特征分析及表達模式以日本沼蝦卵巢cDNA文庫中注釋為圍食膜因子（Peritrophin）同源蛋白的EST為基礎,采用RACE技術成功地克隆了日本沼蝦Peritrophin基因全長cDNA序列。該序列全長654bp,包含一個192bp的5’

14、UTR和一個314bp的3’UTR,開放閱讀框長291bp,編碼96個氨基酸。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)此預測蛋白具有1個跨膜螺旋,一個CBM 14功能域,含有19個信號肽的裂解位點,具有蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點、N-豆蔻酰化位點和蛋白激酶C磷酸化位點等修飾。RT-PCR的研究結果表明,Mn-Peritrophin基因在卵巢和肝胰腺中表達量最高,而在雄性生殖腺中的表達則極其微弱;其表達量在日本沼蝦的卵巢發(fā)育中表現(xiàn)出初級卵黃發(fā)生期平穩(wěn)、成熟期高表達的

15、特征。研究結果提示Mn-Peritrophin基因可能參與了卵母細胞后期成熟過程中卵黃之外的物質的積累,和卵母細胞的最終成熟有關;并且Mn-Peritrophin蛋白可能是日本沼蝦皮質顆粒的組成成分之一,從而推測日本沼蝦成熟卵母細胞中雖然不含皮質棒的結構,卻依然存在皮質顆粒,并且肝胰腺可能是Mn-Peritrophin蛋白的主要合成位點之一。通過以上研究,鑒別、挖掘了29個與日本沼蝦生殖、發(fā)育相關的基因,對于日本沼蝦這種遺傳背景相對薄弱

16、而經(jīng)濟價值又較高的淡水蝦類,不僅為其繁殖生物學在分子水平的研究積累了寶貴的資料,而且為今后進一步開展與生殖相關的功能基因組的研究奠定了基礎。通過對Mn-vasa基因的克隆和表達特征研究,為其成為日本沼蝦潛在的原始生殖細胞形成的分子標記提供了依據(jù)。
　　此外,對日本沼蝦這種卵母細胞中缺乏皮質棒結構的真蝦類卻有組成皮質棒成分的Peritrophin轉錄本存在的發(fā)現(xiàn)及Mn-p68和Mn-DDX39等基因的結構和表達特征的研究,為進一步完

17、善十足類的卵子發(fā)生、繁殖發(fā)育等理論問題提供了更為全面的參考資料。尤其對于DDX39的功能迄今尚未闡明,本研究對Mn-DDX39功能的推測更是為DDX39功能的研究開啟了一扇窗戶,建議今后對DDX39的功能研究可以側重探討其與配子發(fā)生之間的關系。綜上所述,本研究為揭示日本沼蝦卵子成熟調控的分子機制提供了線索,為解決一直困擾著日本沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的卵巢提前成熟現(xiàn)象提供了基礎資料,也為日本沼蝦的遺傳改良提供了理論依據(jù)。另一方面,以基因庫的形式進行了