斑馬魚Z-OTU蛋白在卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育早期的表達(dá).pdf

1、斑馬魚(Danio rerio)是脊椎動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的重要模式動(dòng)物,其卵子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育過程的調(diào)控機(jī)制已經(jīng)引起越來越多研究者們的高度重視。最近的研究表明,泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)參與了哺乳動(dòng)物卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程的許多重要事件,如卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂、第一極體的排放、MⅡ阻滯的維持和克服等。UPP途徑是真核生物細(xì)胞內(nèi)一種高效的蛋白質(zhì)降解途徑,能夠參與體內(nèi)許

2、多重要的生物學(xué)功能,包括細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育、生長控制、凋亡、神經(jīng)元退化等,其表達(dá)異?？梢砸l(fā)許多疾病。去泛素化酶(Deubiqitinating enzymes,DUBs)是UPP的重要組分,具有調(diào)控UPP的重要作用。目前,在斑馬魚中還未見任何有關(guān)DUB的報(bào)道。
　　 我們研究的斑馬魚otu基因(簡稱Z-otu,下同)編碼的蛋白可能具有DUBs活性,它具有一個(gè)典型的otu保守框,屬于otu-like半胱氨酸蛋白酶家族的成員。Z-

3、otu不僅是一個(gè)斑馬魚卵巢特異表達(dá)的基因,而且還是一個(gè)卵子發(fā)生早期和胚胎發(fā)育早期特異表達(dá)的基因。在早期卵母細(xì)胞(卵原細(xì)胞或剛分化的卵母細(xì)胞、Ⅰ-Ⅲ期卵母細(xì)胞)中,Z-otu mRNA有表達(dá)且表達(dá)量呈現(xiàn)出遞減的趨勢；在Ⅳ期卵母細(xì)胞和成熟的卵子(V期卵母細(xì)胞)中幾乎檢測不到該基因的表達(dá)；Z-otu mRNA在合子期到囊胚早期胚胎的胚盤細(xì)胞中表達(dá),而在囊胚晚期之后直到5dpf(不包括5dpf)的胚胎中檢測不到表達(dá)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示Z-O

4、TU是一個(gè)核蛋白,其491-514氨基酸區(qū)域存在一個(gè)長24個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)域,預(yù)測結(jié)果還顯示該蛋白的N端位于膜外,沒有明顯的信號肽區(qū)域,表明其是一個(gè)非分泌蛋白。
　　 為了進(jìn)一步分析Z-OTU蛋白的功能,本文設(shè)計(jì)了特異性引物并采用PCR擴(kuò)增了該基因的otu保守域(簡稱otu1),將該片段插入pGEX-6p-1載體后,與GST標(biāo)簽蛋白融合后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。構(gòu)建好的融合表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切檢測和測序鑒定后,用IPTG誘導(dǎo)

5、并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,得到一個(gè)與預(yù)期目的蛋白分子量(42kDa)相符的條帶。將原核表達(dá)的融合蛋白純化后免疫新西蘭兔,獲得多克隆抗體anti-Z-OTU,并利用該抗體對斑馬魚卵巢和胚胎進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。
　　 斑馬魚卵巢免疫組化檢測結(jié)果顯示,在卵母細(xì)胞初級生長期(Ⅰ期),Z-OTU蛋白定位于生發(fā)泡(GV)內(nèi),而在細(xì)胞質(zhì)中未檢測到該蛋白的表達(dá)；在stageⅡ期和stageⅢ期的卵母細(xì)胞中,Z-OTU蛋白開始向細(xì)胞質(zhì)遷移,主

6、要分布在生發(fā)泡周圍、細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上,在卵黃和皮層小泡中幾乎檢測不到該蛋白的表達(dá)；在stageⅣ期卵母細(xì)胞中,Z-OTU蛋白主要集中在生發(fā)泡的近植物端,在隨后的發(fā)育中伴隨著生發(fā)泡一起向未來的動(dòng)物極遷移。整體熒光免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示Z-OTU蛋白的分布在斑馬魚胚胎發(fā)育早期隨發(fā)育階段的不同而發(fā)生變化:卵母細(xì)胞受精后,Z-OTU蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中,并伴隨著胞質(zhì)流動(dòng)；隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育,Z-OTU均勻的分布在卵裂后的各個(gè)細(xì)胞中,但是在中囊

7、胚轉(zhuǎn)換之后,Z-OTU蛋白主要分布在體節(jié)形成的部位。在斑馬魚胚胎發(fā)育早期,Z-OTU蛋白的表達(dá)量也隨發(fā)育階段的不同而發(fā)生變化:Z-OTU蛋白在30％外包期的表達(dá)量明顯低于在1000細(xì)胞期的表達(dá)量；當(dāng)胚胎發(fā)育到體節(jié)期時(shí),Z-OTU蛋白的表達(dá)量繼續(xù)降低,到13體節(jié)后已檢測不到Z-OTU蛋白。上述結(jié)果表明,Z-OTU蛋白在斑馬魚卵子發(fā)生、受精和胚胎發(fā)育早期可能有著非常重要的生物學(xué)功能。
　　 根據(jù)本研究及以前的研究,我們分析并比較了Z