脂多糖(LPS)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育影響機(jī)制的初步研究.pdf

1、斑馬魚(yú)是一個(gè)非常重要的發(fā)育生物學(xué)和免疫生物學(xué)模式生物，利用斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究人類(lèi)疾病病理過(guò)程，對(duì)于揭示脊椎動(dòng)物發(fā)育和人類(lèi)疾病致病機(jī)理等方面都有著非常重要的學(xué)術(shù)意義。
　　 LPS在哺乳動(dòng)物中誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，并可導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常，包括胚胎吸收、IUFD(intra-uterine fetal death)、IUGR(intra-uterine growth restriction)、早產(chǎn)和流產(chǎn)。但是LPS影響胚胎發(fā)育的機(jī)制

2、尚不確定，本論文利用斑馬魚(yú)開(kāi)展發(fā)育學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)研究LPS影響胚胎發(fā)育的作用機(jī)理。
　　 本論文在本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)LPS刺激斑馬魚(yú)胚胎誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形現(xiàn)象的基礎(chǔ)上，建立了LPS刺激斑馬魚(yú)胚胎的技術(shù)方法，即將LPS(5mg/ml)純組分顯微注射到sphere時(shí)期的斑馬魚(yú)胚胎的動(dòng)物極細(xì)胞間隙，可以引發(fā)大約72％的胚胎發(fā)育缺陷，在bud時(shí)期，LPS刺激的胚胎首次表現(xiàn)出發(fā)育上的異常，相對(duì)于只用PBS刺激的對(duì)照組，顯微注射了LPS的實(shí)驗(yàn)組胚胎的

3、縱向中軸被明顯拉長(zhǎng)，后期的發(fā)育過(guò)程中主要表現(xiàn)為脊椎發(fā)育異常、體節(jié)分化異常、尾部生成缺陷等。為了進(jìn)一步研究LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的機(jī)制，我們建立了LPS刺激前后斑馬魚(yú)胚胎的差減文庫(kù)來(lái)尋找LPS刺激誘導(dǎo)差異表達(dá)的基因。
　　 通過(guò)分析差減文庫(kù)的測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了Notch通路的多個(gè)基因(Her6，Her9，DeltaD)，說(shuō)明Notch通路可能被異常調(diào)控，進(jìn)一步用RT-PCR檢測(cè)Notch家族靶基因在LPS刺激前后的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)對(duì)胚

4、胎發(fā)育有重要功能的Notch家族多個(gè)靶基因(Her1，Her4，Her6，Her7，Her9)在LPS刺激前后表達(dá)變化異常。在LPS刺激后直到首次出現(xiàn)表型的bud時(shí)期，Notch通路多個(gè)靶基因被明顯的下調(diào)。
　　 以上結(jié)果提示Notch信號(hào)可能參與了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的過(guò)程，已有文獻(xiàn)報(bào)道LPS可以通過(guò)NF-kB的激活上調(diào)iNOS表達(dá)，據(jù)此我們提出了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的作用機(jī)制假說(shuō)：LPS通過(guò)TLR4激活了NF-kB，進(jìn)而

5、上調(diào)iNOS和NO的水平，過(guò)量的NO分子抑制了Notch-IC的置換過(guò)程而下調(diào)了Notch信號(hào)，造成一系列靶基因的表達(dá)下調(diào)，繼而影響了胚胎發(fā)育。
　　 為了證實(shí)以上假說(shuō)，本論文從多方面反復(fù)論證。iNOS活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS刺激后30分鐘胚胎的iNOS活性相對(duì)對(duì)照組提高了3.28倍，此時(shí)如果使用iNOS特異性抑制劑1400w可以挽救34％實(shí)驗(yàn)組胚胎的缺陷。在斑馬魚(yú)胚胎的培養(yǎng)液中添加Notch信號(hào)的特異性抑制劑DAPT，可以重復(fù)

6、出部分由LPS注射引發(fā)的發(fā)育缺陷。原位雜交結(jié)果證實(shí)，DAPT刺激下，Hariy-related家族基因(Notch信號(hào)中的下游效應(yīng)基因)的表達(dá)被抑制。過(guò)表達(dá)zNotchl-IC(Notch受體胞內(nèi)區(qū)部分，在Notch信號(hào)傳遞過(guò)程中Notch-IC從膜上被水解后進(jìn)入核內(nèi)激活下游信號(hào))可以挽救20％由LPS引發(fā)的發(fā)育缺陷。以上數(shù)據(jù)初步證明我們提出的關(guān)于LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形作用機(jī)制假說(shuō)。
　　 另外，為了確定LPS在斑馬魚(yú)中的識(shí)別方

7、式是否類(lèi)似哺乳動(dòng)物，可特異的結(jié)合TLR4并誘發(fā)下游iNOS上調(diào)表達(dá)，我們分別在胚胎中注射zTLR4amorpholino(MO)和zTLR4b MO。胚胎分裂期注射zTLR4a MO引發(fā)了嚴(yán)重的發(fā)育畸形，可導(dǎo)致胚胎48小時(shí)內(nèi)死亡，據(jù)此我們無(wú)法判斷zTLR4a是否參與了LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形的過(guò)程。另一方面，胚胎分裂期注射zTLR4b MO沒(méi)有引發(fā)胚胎發(fā)育上的異常，且可以挽救13％的LPS刺激后被誘發(fā)發(fā)育缺陷的胚胎，證明zTLR4b參與了

8、LPS誘發(fā)胚胎發(fā)育畸形過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期工作顯示在各種革蘭氏陰性菌粗毒素刺激條件下成體斑馬魚(yú)中zTLR4b的基因表達(dá)上調(diào)幅度明顯高于zTLR4a，暗示zTLR4b在斑馬魚(yú)天然免疫中起著重要的作用。
　　 綜上所述，我們推測(cè)，LPS可能通過(guò)了TLR4通路，iNOS，NO，和Notch通路協(xié)同作用誘發(fā)了胚胎發(fā)育異常，TLR4b參與了這個(gè)過(guò)程。zTLR4a和zTLR4b可能分別側(cè)重不同的生物學(xué)功能，前者側(cè)重于發(fā)育功能，