外源p204和cbfal對斑馬魚胚胎發(fā)育和骨生成的影響.pdf

1、骨骼有兩個明顯的特征:一是廣泛分布于軀體并且組成骨骼的元件形狀形態(tài)具有獨(dú)特性,二是骨骼由兩種不同的組織(成骨和軟骨)組成。骨骼的形成主要通過軟骨內(nèi)成骨(endochondral ossification)和膜內(nèi)成骨(intramembranousossification)兩種方式。脊椎動物骨骼的生成是一個復(fù)雜并高度有序的過程。作為轉(zhuǎn)錄生長因子runt/Cbfa家族的一個成員,Cbfa1(runx2)通過其runt結(jié)構(gòu)域結(jié)合到DNA上激活

2、成骨細(xì)胞中骨鈣蛋白基因的表達(dá)。在成骨分化過程中,p204作為Cbfa1的輔助激活因子共同促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。BMP2誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞C2C12向成骨細(xì)胞分化過程中,p204表達(dá)量增加;p204,Cbfa1和pRb蛋白組成三元復(fù)合體共同參與了成骨細(xì)胞分化的過程。
　　 模式動物斑馬魚因其個體小、性成熟周期短、體外受精和發(fā)育、胚體透明容易觀察、便于顯微操作等優(yōu)勢,現(xiàn)已用于發(fā)育生物學(xué)相關(guān)研究,取得了許多進(jìn)展。目前,雖然斑馬魚還沒有廣泛應(yīng)

3、用于骨發(fā)育和相關(guān)疾病的研究,但已有許多研究證明了其可行性。斑馬魚骨骼可以分頭部骨骼、軀體骨骼和鰭三種,在骨骼生成與發(fā)育過程中有著從頭到尾的有序骨化的過程,頭部首先形成,接著軀干骨化,與軀干骨化的同時鰭逐漸形成。Manuel等認(rèn)為斑馬魚的鰭質(zhì)鱗條雖然不是一個典型的骨骼組織,但其再生過程對于骨組織功能紊亂的臨床前研究具有重要的意義。
　　 我們以斑馬魚為模式動物,采用顯微注射的方式將外源p204和cbfa1導(dǎo)入其單細(xì)胞胚胎內(nèi),通過觀

4、察胚胎中融合蛋白GFP的熒光表達(dá),發(fā)現(xiàn)兩種融合質(zhì)粒在斑馬魚胚胎中從8 hpf時期開始表達(dá),表達(dá)位置主要集中在胚胎的胸腹部,頭部和尾鰭處有較少表達(dá)。胚胎發(fā)育至8 dpf時,熒光表達(dá)量開始減少,約12 dpf后熒光徹底消失。兩種質(zhì)粒p204-EGFP和cbfa1-EGFP注射誘導(dǎo)斑馬魚幼魚產(chǎn)生大量畸形,以腹部膨大、脊椎彎曲、心胸部變異、尾部彎曲變短、頭部畸形等為主。這些較嚴(yán)重畸形幼魚只有少部分可存活下去。
　　 通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)

5、外源p204和cbfa1單獨(dú)注射都可以誘導(dǎo)斑馬魚骨骼生成相關(guān)標(biāo)志基因和關(guān)鍵基因osx,vent,tcf7表達(dá)量顯著上調(diào),而p204和cbfa1雙質(zhì)粒注射組相關(guān)基因的表達(dá)量高于任一單獨(dú)注射組。進(jìn)一步通過原位雜交檢測osx,tct7在質(zhì)粒注射后的時空表達(dá),研究結(jié)果表明這兩個基因表達(dá)時間提前,并且表達(dá)區(qū)域也有所擴(kuò)展。同時,外源p204和cbfa1都可以誘導(dǎo)促進(jìn)斑馬魚軟骨,特別是pharyngeal arches軟骨的分化,刺激成骨的形成,與相

6、關(guān)成骨基因表達(dá)量高于單獨(dú)注射組結(jié)果類似,在促進(jìn)骨骼的生長和軟骨的分化過程中,雙質(zhì)粒注射組結(jié)果也更加明顯。研究表明:1.外源p204和cbfa1都可以參與斑馬魚骨骼生成分化過程中,并在一定程度上促進(jìn)或更改(造成畸形發(fā)育)這一進(jìn)程;2.p204可以促進(jìn)cbfa1(或runx2b)作為骨骼生長中心因子參與骨骼生成,二者共同作用促進(jìn)斑馬魚硬骨形成。本研究為進(jìn)一步以斑馬魚為模式動物闡明以runx2b為中心的骨骼發(fā)生相關(guān)的分子機(jī)制提供了依據(jù)。