革蘭氏陽性中度嗜鹽菌甘氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和功能分析.pdf

1、摘 要H a l o b a c i l l u s t r u e p e r i 分 離自 美 國 鹽 湖， 能 夠 在 含。 . 5 % ^ 2 5 % N a C l ( w / v ) 鹽 濃 度條 件下 生 長 ， 其 最 適 生長 鹽 濃 度 為5 % ^ ' 1 0 % e “ C NM R( 核 磁 共 振) 檢 測 到 在 含1 0 %N a C l ( w / v ) 的S W Y E培 養(yǎng)基 上生

2、 長 的H . t r u e p e n 細胞內(nèi) 積累 高 濃 度的 甘氮 酸 甜菜 堿。 根 據(jù) 革蘭氏 陽 性菌 甘 氨酸 甜 菜 堿轉(zhuǎn)運蛋白 氨基酸的 保守序列設(shè)計簡并引 物一對， 經(jīng)P C R獲 得大小約 1 k b 的 核普酸片 段。 將擴增片 段 用 地 高 辛 標(biāo) 記 成 探 針， 與 用 不 同 限 制 性內(nèi) 切 酶 完 全 酶 切 的H . t r u e p e r i 總D N A 片 段 作S o u t

3、 h e r n雜交， 結(jié)果顯 示在E c o R l 酶切片 段的5 . 1 k b 處 有陽 性信號。 通過反向P C R 擴增獲得b e t H基因片段的 側(cè)翼 序列。 通過B L A S T比 較， 證實獲 得b e t H基因的 全部編碼序列。 B e t H屬于B C C T 家族。將 包 括 整 個b e t H 基 因O R F 框 及 可 能 的 啟 動 子 核 普 酸 序 列 在內(nèi) 的2 . 6 k b 的 片

4、段 克 隆 到P U C 1 8 載 體上， 轉(zhuǎn)入到大腸桿菌 甘氨酸甜菜堿缺失株 M K H 1 3中. 使該菌 株能夠在含甘氨酸甜菜堿的高 鹽M 9 培 養(yǎng) 基 上 生 長 ， 而 對 照 實 驗 不 能 生 長 。 使 用’ 3 C - N M R 技 術(shù)， 檢 測 到 在E . c o l i ( p U H 2 5 ) 中 有甘氨酸甜菜堿的積累。在H t r u e p e n 發(fā) 現(xiàn) 有 甘 氨 酸 甜 菜 堿A B

5、C 轉(zhuǎn) 運 系 統(tǒng). 首 先 通 過 該 轉(zhuǎn) 運 系 統(tǒng)A T P 結(jié) 合 蛋白 氨 基酸 的 保 守 序 列 設(shè) 計簡 并 引 物 一 對 ， 獲 得 約5 6 0 b p 的 部 分 核 昔 酸 序 列 。 將 擴 增 片 段 用 地高 辛 標(biāo) 記 成探 針， 與 用 不同 限 制 性內(nèi) 切 酶 完 全 酶 切 的H . t r u e p e n 總D N A 片 段 作S o u t h e r n雜 交， 結(jié) 果 顯 示 在

6、E c o R l 酶切片段的2 . 6 k b 處有陽 性信號。 通過反向P C R 擴增獲得^ A T P 結(jié)合蛋白 基因 片 段的 側(cè)翼序列。 通過 B L A S T比 較， 表明 獲得完整的A T P 結(jié)合蛋白 墓因O R F 框序列及 其上游的核普酸序列。 再次. 根據(jù)甘氨酸甜菜堿A T P 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)底物結(jié) 合蛋白 的氮荃酸保守 序列設(shè) 計下游簡并引 物，與A T P 結(jié)合蛋白 的 上 游簡并引 物組 合， 經(jīng)P C R

7、擴增獲得2 . 1 k b 的條帶， 測序后 通過B L A S T比 較，結(jié)果顯示 獲得 A T P結(jié)合蛋白 基因 的部分序列、 通透酶的 全部編碼序列和部分 甘氨酸甜菜堿結(jié)合蛋白 基因的核昔酸序列。 將2 . 1 k b P C R 產(chǎn)物用 地高 辛標(biāo)記為 探針后， 與 用不同限 制性內(nèi) 切酶完 全酶 切 的H t r u e p e r i 總D N A 片 段 作S o u t h e m雜 交 ， 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 在理

8、 刀 1 1 酶 切 片 段的5 . 2 k b 處 有 陽 性 信號。 通過反向I $ C R 擴增獲 得探針的 側(cè)冀序列。 B L A S T比 較結(jié)果顯 示獲得完整的 甘氨酸甜菜堿結(jié)合蛋 白 編 碼 框 序 列 及 其 下 游的 核 昔 酸 序 列 。 進 一 步 在o p u A 荃 因 的 上 下 游 序 列 分 別 設(shè) 計 引 物， 從H . t r u e p e r i 基 因 組D N A 中 擴 增 出 所 預(yù)

9、期 大 小 的 片 段 . 側(cè) 序 驗 證已 獲 得o p u A 基 因 的 全 序 列 。H a l o b a c i l l u s s p . D 8 是 從 新 強 達 坂 城 地 區(qū) 鹽 湖 分 離 的 革 蘭氏 陽 性 中 度 啥 鹽 菌 。 在 含1 0 % N a C l的S WY E 培養(yǎng)荃上生 長良 好. 將其總D N A用S a u 3 A l 部分酶切后， 收集4 ^ - 1 5 k b 大小的 酶切

10、片段， 克 隆 到 用B a m H l 酶 切 的P U C 1 8 中 ， 構(gòu) 建H a l o b a c i l l u s s p . D 8 基因 組 文 庫。 共 獲 得 約9 0 0 0 個重組 質(zhì)粒。 利用上述合成的簡并引物. P C R 擴增獲 得甘氮酸甜菜堿轉(zhuǎn)運蛋白b e t H荃因 約 1 k b 大小的片 段。 將P C R 擴增片段用地高 辛 標(biāo)記 探針， 利用原 位雜交和菌落P C R 從基因文庫中

11、獲 得含有陽 性信號的重組質(zhì)粒。 將重組質(zhì) 粒測序， 插入片段大小 為4 k b 左右， 通過B L A S T比 較， 結(jié)果顯示 含有三個O R F 框， 其中 一個為 甘氨 酸甜菜堿轉(zhuǎn) 運蛋白。 對其氨基酸組成進行 疏水 性分析，推測為含 有 1 2 個跨膜域的 跨膜蛋白， 屬于B C C T 家族。關(guān)鍵詞: 反向P C R ， 甘 氨 酸 甜 菜堿， “ C - N M R , 荃因 文 庫， 轉(zhuǎn) 運蛋白a n d s e q

12、 u e n c e d . T h e i n s e r t e d D N A f r a g m e n t w a s a b o u t 4 . 3 k b . A n a l y s i s o f t h e D N A s e q u e n c e r e v e a l e dt h e e x i s t e n c e o f t h r e e O R F s . O n

13、 e o f t h e m w a s i d e n t i f i e d a s t h e b e i H g e n e o f H a l o b a c i l l u s s p . D 8 . Ah y d r o p h o b i c i t y p l o t o f B e t H r e v e a l e d a n a l t e r a t i o n o f

14、 h y d r o p h o b i c a n d h y d r o p h i l i c s e g m e n t s t h a t w a sc h a r a c t e r i s t i c f o r i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f

15、 1 2 t r a n s m e m b r a n e - s p a n n i n gs e g m e n t s a n d b e l o n g e d t o B C C T f a m i l y .K e y w o r d s : H a l o b a c i l l u s , I P C R , g l y c i n e b e t a i n e , 1 3 C - N M R