煙草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族鑒定及次生代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能研究.pdf

1、煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物和科研模式植物。煙草在生長過程中產(chǎn)生非常豐富的次生代謝產(chǎn)物,如生物堿、酚類和萜類等化合物,這類物質(zhì)的產(chǎn)生是煙草在長期進(jìn)化中對生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果,它們在煙草抵御昆蟲的侵襲、增強(qiáng)抗逆、抗病等方面起著重要作用。同時(shí),煙草的次生代謝物質(zhì)已被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、食品和農(nóng)藥等領(lǐng)域。作物一種特殊而又重要的經(jīng)濟(jì)作物,從某種程度上說,煙草的使用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值與它的次生代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。因此,開展煙草次生代謝工程和代謝調(diào)控的研究有著重要的意

2、義,其中,通過基因工程技術(shù)進(jìn)行次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的研究是調(diào)控次生代謝物質(zhì)的有效途徑。煙草次生代謝物質(zhì)種類繁多,但其在次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累方面的研究相對滯后。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是廣泛存在與自然界生物體中的一類超家族跨膜蛋白。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累過程中扮演重要的角色,已經(jīng)成為近年來植物次生代謝工程重點(diǎn)研究方向之一。為了從分子水平研究煙草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對次生代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與積累的機(jī)制,本研究對煙草基因組范圍內(nèi)AB

3、C轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的分析,并針對煙草次生代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能研究等方面開展了一系列的工作。主要研究內(nèi)容包括：
　?、倩谠耘酂煵萜贩N紅花大金元的基因組數(shù)據(jù)和預(yù)測基因,在煙草基因組中鑒定到265個(gè)ABC基因,約占煙草基因總數(shù)的0.4％,這是目前已知生物體中最大的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。對煙草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了家族分類、命名、結(jié)構(gòu)形式以及亞細(xì)胞定位等基本信息的分析,其中,ABCG亞家族是煙草最大的ABC亞家族,占煙草總ABC基因的56％

4、,是目前植物ABC亞家族中成員最多,占比例最大的亞家族;ABCE亞家族僅含有2個(gè)ABC蛋白,是煙草最小的ABC亞家族。
　?、诜治霰容^了煙草ABC基因與其它物種ABC基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果表明煙草ABCA亞家族基因的進(jìn)化速度較快,物種間的直系同源關(guān)系不明顯,煙草ABCE亞家族最保守,而ABCC和ABCG亞家族基因呈現(xiàn)出明顯的物種特異性擴(kuò)增現(xiàn)象;另外,從大多數(shù)煙草ABC亞家族中鑒定到了一些其他植物中已知功能的ABC同源基因。

5、>　?、刍跓煵?ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)據(jù),篩選并克隆了一個(gè)參與煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)的候選基因-NtWBC13,屬于ABCG亞家族,編碼一個(gè)半分子的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,膜蛋白亞細(xì)胞定位軟件分析結(jié)果顯示, NtWBC13定位在細(xì)胞膜上;半定量 PCR和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), NtWBC13基因的轉(zhuǎn)錄水平受煙堿、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)和損傷處理的誘導(dǎo);多序列比對結(jié)果表明,NtWBC13與其他植物WBC蛋白的氨基酸序列在Wal

6、ker A、Walker B以及ABC標(biāo)簽基序處高度保守。
　　④利用qRT-PCR技術(shù)分析了煙草NtWBC13的組織表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)其在的根中有較高的表達(dá)量;克隆了NtWBC13的啟動(dòng)子序列,啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫軟件分析結(jié)果顯示,NtWBC13啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)參與損傷應(yīng)答的元件 CATG-box(CATG)、W-box(TCACC/T)和根系優(yōu)勢表達(dá)的元件 ROOTMOTIFTAPOX1(ATATT);構(gòu)建了pNtWBC13/GUS的表

7、達(dá)載體,經(jīng)Gus組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),在煙草主根部位有明顯GUS信號,表明NtWBC13可能在根部發(fā)揮著重要的作用。
　?、轂榱藱z測NtWBC13是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)煙堿的功能,將煙草NtWBC13異源表達(dá)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中,在添加有煙堿的培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過提取酵母中的煙堿,經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn),在不同濃度的煙堿培養(yǎng)條件下,與對照株相比,NtWBC13酵母轉(zhuǎn)化株具有較強(qiáng)的煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)能力;不同時(shí)間段的積累結(jié)果也表明,NtWBC13酵母轉(zhuǎn)化株同樣具有較

8、強(qiáng)的積累煙堿的能力。通過RNAi技術(shù)降低煙草中NtWBC13基因的表達(dá)量之后,干擾株根部的煙堿積累能力降低;當(dāng)在培養(yǎng)基中添加了煙堿后,發(fā)現(xiàn)后代干擾株系種子的萌發(fā)和生長能力受到不同程度的抑制。以上結(jié)果表明NtWBC13是一個(gè)煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,很可能在煙草主根部位調(diào)控?zé)焿A的積累過程。
　?、蕺?dú)腳金內(nèi)酯是一類新型植物激素,最近發(fā)現(xiàn)其具有抑制植物側(cè)枝發(fā)育的功能?；诎珷颗＊?dú)腳金內(nèi)酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PhPDR1的序列,通過比對搜索煙草ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)據(jù)

9、,在煙草中鑒定了一個(gè)與矮牽牛PhPDR1高度同源的蛋白-NtPDR6。通過分段克隆法拼接得到全長序列,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析,NtPDR6屬于煙草ABCG基因亞家族,具有植物PDR蛋白典型的“NBD-TMD”反向結(jié)構(gòu)特征。多序列比對分析表明,NtPDR6與植物PDR蛋白的氨基酸序列在Walker A、Walker B和ABC標(biāo)簽基序位點(diǎn)處高度保守。亞細(xì)胞定位分析軟件將其定位在細(xì)胞膜上。通過進(jìn)化分析顯示,煙草 NtPDR6與 PhP

10、DR1互為直系同源蛋白,兩者的氨基酸序列相似度高達(dá)93％。
　　⑦利用qRT-PCR技術(shù)調(diào)查了經(jīng)低磷和生長素處理后的NtPDR6基因表達(dá)情況,分析發(fā)現(xiàn)NtPDR6轉(zhuǎn)錄水平受低磷和生長素的顯著誘導(dǎo)上調(diào)。不同組織的表達(dá)分析結(jié)果顯示NtPDR6在根中的表達(dá)量最高,莖中次之,而在葉和花中的表達(dá)量很低?？寺〔⒎治隽薔tPDR6基因啟動(dòng)子的序列,發(fā)現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域存在1個(gè)低磷應(yīng)答的Pho-like元件(GACGTGG)和4個(gè)根系優(yōu)勢表達(dá)的元件R

11、OOTMOTIFTAPOX1(ATATT)。NtPDR6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,在側(cè)根表皮細(xì)胞、根尖分生區(qū)以及近地面區(qū)莖部的側(cè)芽區(qū)有較強(qiáng)GUS信號;低磷處理可以進(jìn)一步增強(qiáng)GUS信號。NtPDR6基因與矮牽牛 PhPDR1基因表達(dá)模式相似,推測 NtPDR6很可能與PhPDR1有著相似的基因功能。
　　⑧通過RNA干擾技術(shù)降低NtPDR6基因表達(dá)量后,干擾株的分枝明顯增加,且隨著植株的生長,分枝表型越明顯。該表型與獨(dú)