ABC轉運蛋白在鼻咽癌中的表達研究.pdf

1、腫瘤是危害人類健康的重大疾病，在腫瘤的治療中，多藥耐藥現(xiàn)象一直是限制腫瘤化療成功的主要原因。引起腫瘤多藥耐藥的機制非常復雜，其中ABC轉運蛋白所介導的腫瘤多藥耐藥備受關注。 ABC轉運蛋白全稱為ATP結合盒膜轉運蛋白(ATPBindingCassetteTransporters)，它們能夠介導多種底物分子在細胞內外的運輸。研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉運蛋白的泵功能與腫瘤細胞內藥物聚集的降低有關，能夠使腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥性(Multidr

2、ugresistance，MDR)從而導致化療失敗。而隨著腫瘤干細胞學說的提出，更認為在化療中，腫瘤干細胞上轉運蛋白表達增強，對藥物外排的增加使腫瘤逃避化療藥物攻擊，存活并復發(fā)、轉移。其中尤以ABCG2更受到人們關注，認為它不僅是耐藥蛋白，同時也可能是干細胞的潛在標志物。 鼻咽癌是我國南方常見的上皮性惡性腫瘤。高發(fā)地區(qū)的發(fā)病率可達14.68-18.53/10萬人口，死亡率為12.46/10萬人口。在鼻咽癌的治療中，由于就診病人多

3、為中晚期患者，單純的放療不能有效緩解臨床癥狀，局部復發(fā)和遠處轉移率很高，因此必須結合有效的化療。而研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌中存在多藥耐藥的現(xiàn)象，是鼻咽癌化療效果無法進一步提高的主要原因。因此檢測與耐藥相關的ABC轉運蛋白在鼻咽癌細胞株及組織中的表達情況，初步探討鼻咽癌中多藥耐藥的機制，是非常有意義的。 采用SYBRGreenⅠQRT-PCR(quantitatierealtimePCR)技術對靶基因進行實時熒光定量分析是近年來發(fā)展起來的

4、一項新技術。SYBRGreenⅠ是一種能與雙鏈DNA結合發(fā)光的熒光染料。因此，它的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量，并且通過熔解曲線的分析，排除非特異性擴增的干擾，對靶基因進行定量分析，準確性和靈敏性都比普通RT-PCR高。通過2-△△CT方法利用SYBRGreenⅠQRT-PCR技術能夠很好的分析基因表達相對差異。用2-△△CT統(tǒng)計分析基因表達相對定量的方法在很多文獻中有報道，

5、由于這種方法無需做標準曲線，因此比絕對定量方法更加簡便可行。 目前國內外關于ABC轉運蛋白在鼻咽癌中的研究并不多見，并且多是采用免疫組化方法從蛋白水平研究多藥耐藥蛋白MDR1(ABCB1基因編碼)和多藥耐藥相關蛋白MRP1(ABCC1基因編碼)的文章，對于ABC轉運蛋白在鼻咽癌中的表達情況缺乏系統(tǒng)了解。因此，我們采用準確性和靈敏性較高的QRT-PCR技術檢測了ABC轉運蛋白家族中十個與耐藥密切相關的成員(ABCA2、ABCB1、

6、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCC6、ABCC11、ABCG2)在鼻咽癌細胞株5-8F、6-10B、CNE-1、CNE-2、HNE-1以及25例鼻咽癌組織中的表達情況，并以一個含多例鼻咽正常組織的混合RNA作為正常對照，通過2-△△CT方法和t檢驗分析了十種基因在鼻咽癌細胞株、鼻咽癌組織與鼻咽正常組織中的表達差異；同時我們用化療藥物順鉑作用于鼻咽癌細胞株5-8F，比較了其在藥物誘導前后ABC轉運蛋白表達

7、的變化。此外，還采用原位雜交檢測方法對ABCG2基因在鼻咽癌組織中的表達進行了定位分析。 熒光實時定量PCR的結果表明在鼻咽癌細胞株中，ABCA2、ABCC1、ABCC2和ABCC3均為高表達，ABCG2在五種細胞株中均穩(wěn)定低表達，而經(jīng)典耐藥蛋白MDR的編碼基因ABCB1的表達則非常低，僅6-10B細胞中有極低表達。在25例鼻咽癌組織中，ABCA2、ABCC1和ABCC3也有較高的表達，其△Ct值均＜10，而ABCG2表達量較低

8、，25例組織中20例均為低表達。再通過2-△△Ct的方法分別比較了ABC轉運蛋白在鼻咽癌組織、鼻咽癌細胞株與正常鼻咽組織中的相對表達差異，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌組織和鼻咽癌細胞株中ABC轉運蛋白的表達水平相對與正常鼻咽組織具有一致性，即ABCA2、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5以及ABCG2的表達均高于其在正常鼻咽組織中的表達，而ABCC6、ABCC11和ABCB1都低于其在正常鼻咽組織中的表達。通過T-test檢驗

9、，我們得到了ABCC1、ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2這五個基因在鼻咽癌組織中的表達要顯著高于其在正常鼻咽組織中的表達(P＜0.05)。 同時，我們檢測經(jīng)順鉑誘導后5-8F細胞株中ABC轉運蛋白的表達變化，結果提示ABCC1和ABCC4這兩種基因的表達上調是比較明顯的，分別比未經(jīng)順鉑誘導的5-8F細胞株中這兩種基因的表達升高了3.05倍和8.16倍。 對ABCG2基因在鼻咽癌組織中的原位雜交結果顯示，AB

10、CG2基因的表達定位于鼻咽癌實質細胞，在淋巴細胞和間質中沒有表達；在所檢測的36例鼻咽低分化鱗狀細胞癌中，ABCG2表達陽性的有6例。 根據(jù)實驗結果，我們把這十種ABC蛋白的表達情況分為三類，第一類是在鼻咽癌組織和正常鼻咽組織中都高表達的基因，包括ABCA2、ABCC1和ABCC3，其中ABCA2和ABCC3在鼻咽癌組織和正常鼻咽組織中的表達沒有顯著差異，而ABCC1在腫瘤組織中的表達則要明顯高于其在正常組織中的表達，并且ABC

11、C1編碼的多藥耐藥相關蛋白MRP1的高表達是導致許多腫瘤內在性耐藥的原因，因此這提示鼻咽癌也存在天然耐藥性，當使用的化療藥物為這些轉運蛋白的轉運底物時，它們對鼻咽癌的化療效果是非常差的。 第二類是在正常鼻咽組織中低表達而在鼻咽癌中表達顯著升高的，比如ABCC2、ABCC4、ABCC5和ABCG2，因此它們在鼻咽癌的耐藥中可能起著重要作用。其中ABCG2基因我們同時用了QRT-PCR和原位雜交方法相結合來檢測，結果顯示它的表達量在