家蠶體液蛋白Bmhp20的功能研究.pdf

1、昆蟲的生存環(huán)境非常特殊,為了生存和種群的繁衍,昆蟲在長期與病原菌的斗爭過程中形成了強(qiáng)大的免疫系統(tǒng)。昆蟲為先天性免疫系統(tǒng),它通過體內(nèi)的模式識別受體識別外源病原物的保守特征,進(jìn)而引起體液免疫和細(xì)胞免疫。具有抗菌作用的抗菌肽的合成就屬于體液免疫而細(xì)胞免疫則包括吞噬作用和包裹作用等。病原物識別蛋白在昆蟲的先天性免疫體系中具有重要作用。肽聚糖識別蛋白識別肽聚糖能引起抗菌肽的產(chǎn)生,另外葡聚糖識別蛋白識別葡聚糖也能引起類似的生理反應(yīng)。除這兩個研究比較

2、清楚的識別蛋白家族外,還有其它類型的識別蛋白在昆蟲對外界的免疫反應(yīng)中也起著重要作用。
　　 CIb1是從家蠶體液中純化得到的具有胰凝乳蛋白酶抑制活性的Kunitz型蛋白酶抑制劑。近期的研究表明CIb1參與家蠶的免疫反應(yīng),具有脂多糖的結(jié)合活性。推測其可能介導(dǎo)外源物刺激的信號傳導(dǎo)。
　　 本研究旨在進(jìn)一步了解CIb1在家蠶體內(nèi)的功能,首先通過蛋白質(zhì)的相互作用,獲取其在體液中的結(jié)合蛋白。根據(jù)其N端氨基酸序列,克隆得到編碼該蛋白

3、的全長cDNA(命名為Bmhp20)。通過體外表達(dá)純化Bmhp20蛋白,再對其功能進(jìn)行分析。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑CIb1的純化及與體液蛋白的相互作用
　　 CIb1是堿性的小分子胰凝乳蛋白酶抑制劑,能夠在體外抑制胰凝乳蛋白酶的活性。根據(jù)這些特點(diǎn)制定純化策略,在純化的過程中利用其胰凝乳蛋白酶抑制劑的活性進(jìn)行監(jiān)測。首先利用硫酸銨進(jìn)行沉淀,去掉部分雜蛋白。再根據(jù)CIb1的分子量和等電點(diǎn)通過凝膠

4、層析和離子交換純化?；钚匀旧唾|(zhì)譜確定純化的CIb1為具有活性的單一蛋白。CIb1用生物素標(biāo)記后與家蠶的體液進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。Far-Western結(jié)果顯示CIb1與未處理的家蠶體液蛋白不存在相互作用;但是CIb1與脂多糖刺激后的家蠶體液蛋白存在相互作用。
　　 2.CIb1蛋白的原核表達(dá)、純化及與體液蛋白的相互作用
　　 將編碼CIb1成熟蛋白的基因克隆到pDEST17中進(jìn)行原核表達(dá)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta、Origam

5、i B(DE3)、BL21(DE3)、JM109(DE3)四種原核表達(dá)菌株后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。CIb1是具有3對二硫鍵的胰凝乳蛋白酶抑制劑,表達(dá)的蛋白要能夠在原核系統(tǒng)體系中正確折疊才能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。通過胰凝乳蛋白酶抑制劑活性染色篩選后發(fā)現(xiàn)帶有trxB和gor的雙突變的origami B(DE3)能夠表達(dá)出有活性的重組CIb1蛋白(rCIb1)。rCIb1在origami B(DE3)主要以包涵體的形式存在。將表達(dá)的包涵體形式的rCIb1用

6、尿素助溶,S200凝膠柱進(jìn)行純化的同時進(jìn)行復(fù)性?；钚匀旧砻骷兓膔CIb1蛋白具有活性。前面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明CIb1能夠與誘導(dǎo)后的家蠶體液蛋白發(fā)生相互作用。在rCIb1與脂多糖誘導(dǎo)24小時后的家蠶體液的pull down實(shí)驗(yàn)中,rCIb1在Ni-NTA柱上與體液蛋白發(fā)生相互結(jié)合反應(yīng)。用漂洗緩沖液洗掉與Ni-NTA非特異結(jié)合的蛋白之后,用高濃度咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫,發(fā)現(xiàn)洗脫的高分子量蛋白能夠用CIb1的抗體雜交顯色。推測此處可能是CI

7、b1與家蠶體液蛋白形成的復(fù)合體,此復(fù)合體具有SDS穩(wěn)定性。通過電洗脫對蛋白進(jìn)行分離并做N末端測序。測序得到該蛋白N端20個氨基酸為HGSSDVDGSGEVEAVAGTLK,分析表明該蛋白沒有被前人研究過。
　　 3.CIb1結(jié)合蛋白Bmhp20編碼基因的全長克隆及表達(dá)分析
　　 蛋白N端序列HGSSDVDGSGEVEAVAGTLK在家蠶數(shù)據(jù)庫進(jìn)行tBLASTn搜索,一個預(yù)測基因BGIBMGA002175的序列與之相匹配。

8、根據(jù)該基因的EST序列,設(shè)計(jì)引物克隆并測序驗(yàn)證該基因,驗(yàn)證結(jié)果顯示該基因序列與結(jié)合蛋白的測序序列相一致,證明克隆的基因就是結(jié)合蛋白的基因序列。再對基因的5’端進(jìn)行克隆,得到全長序列。該基因全長740 bp,開放閱讀框645 bp,編碼215個氨基酸的肽段。N端18個氨基酸為信號肽區(qū)域,預(yù)測分子量為21.5 kDa,等電點(diǎn)為5.5。根據(jù)這個結(jié)合蛋白的分子量和蛋白存在的形式,命名為Bmhp20(基因登錄號:GU015849)。Bmhp20基

9、因由三個外顯子和二個內(nèi)含子構(gòu)成。編碼成熟蛋白的基因序列都在最后一個外顯子上。NCBI Blast分析顯示在其它物種中不存在與Bmhp20相類似的氨基酸序列。對氨基酸序列組成成分分析發(fā)現(xiàn),Bmhp20主要由少數(shù)幾種氨基酸構(gòu)成,甘氨酸占氨基酸總量的26.9％,絲氨酸占13.2％,苯丙氨酸12.2％,天冬氨酸10.7％,組氨酸9.1％。在ELM數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),Bmhp20富含氨基葡聚糖結(jié)合位點(diǎn)(DGSGE,DNSGF,NSGF,HSGF,DS

10、GF,DSAL)。
　　 家蠶五齡三天組織表達(dá)芯片分析表明Bmhp20基因的表達(dá)沒有雌雄差異性,在頭、體壁、脂肪體和卵巢四個組織有表達(dá)。這個結(jié)果與RT-PCR分析的Bmhp20表達(dá)情況相一致。用RT-PCR分析Bmhp20基因在家蠶整個發(fā)育時期的表達(dá)結(jié)果顯示,Bmhp20基因在家蠶的整個幼蟲期都有高量表達(dá)。在上蔟的第一天表達(dá)量高,之后受到抑制。在化蛹第四、五天又出現(xiàn)一個高量表達(dá)峰。
　　 由于CIb1參與家蠶的免疫反應(yīng),

11、而CIb1與Bmhp20在外源物刺激下發(fā)生相互作用,推測Bmhp20可能也參與免疫反應(yīng)。家蠶用大腸桿菌、黑胸?cái)⊙挎邨U菌、白僵菌刺激后,定量RT-PCR檢測Bmhp20的mRNA在脂肪體的表達(dá)變化。與對照相比,在注射大腸桿菌后1小時,Bmhp20的mRNA迅速上升,隨后表達(dá)受到抑制。在白僵菌的刺激下,Bmhp20的表達(dá)也是迅速上升,在3、6小時受到抑制,在12小時的時候表達(dá)又發(fā)生上調(diào)。對Bmhp20的表達(dá)影響最大的黑胸?cái)⊙?它對Bmh

12、p20的影響比其它兩種病菌都要高,且在24小時達(dá)到最大。Bmhp20基因?qū)谛財(cái)⊙挎邨U菌的強(qiáng)烈反應(yīng)可能暗示該基因在家蠶應(yīng)對其主要細(xì)菌性敗血病原(黑胸?cái)⊙挎邨U菌)時起著重要作用。
　　 4.His-Bmhp20融合蛋白的原核表達(dá)、純化及抗體的制備
　　 將編碼Bmhp20成熟蛋白的基因克隆到pET28a載體上,Bmhp20基因有大量的稀有密碼子,選用Rosetta菌株進(jìn)行表達(dá)。誘導(dǎo)蛋白成分分析表明,Bmhp20蛋白在R

13、osetta菌株中能夠以可溶形式表達(dá),這有利于后續(xù)對蛋白功能的研究。表達(dá)的蛋白帶有六個組氨酸的融合標(biāo)簽,用Ni-NTA樹脂進(jìn)行親和純化,再通過Superdex75凝膠柱對樣品進(jìn)行進(jìn)一步的純化。Bmhp20蛋白的氨基酸組成中有大量組氨酸,為消除六個組氨酸的融合標(biāo)簽可能造成的實(shí)驗(yàn)影響,需要對標(biāo)簽進(jìn)行切除。將純化的帶標(biāo)簽的蛋白His-Bmhp20用凝血酶進(jìn)行消化,消化完后凝血酶殘留用streptavidin Agarose去除,切開的六組氨酸

14、標(biāo)簽使用Superdex75凝膠層析去除,得到純的Bmhp20。用Bmhp20免疫成年公兔,制各多克隆抗體,檢測效價達(dá)到1:100000后取血清,抗血清純化后保存于-30℃?zhèn)溆谩?br>　　 5.Bmhp20的功能分析
　　 1)Bmhp20蛋白合成后分泌于家蠶體液中
　　 Bmhp20的氨基酸序列分析顯示其具有氨基葡聚糖結(jié)合位點(diǎn),可能參與家蠶的免疫識別。家蠶五齡三天幼蟲的各組織蛋白的Bmhp20免疫雜交顯示Bmhp2

15、0信號只在家蠶體液中出現(xiàn),其它組織均檢查不到Bmhp20。同時Bmhp20是在家蠶體液中鑒定出來的與CIb1有相互作用的蛋白,這些都表明Bmhp20是在家蠶體液中存在并行使功能的蛋白。
　　 2)Bmhp20不具有水解酪蛋白的功能
　　 Bmhp20與胰凝乳蛋白酶抑制劑CIb1能相互結(jié)合,首先考慮Bmhp20在家蠶體內(nèi)可能作為水解酶并調(diào)控家蠶的生理反應(yīng),由CIb1控制其反應(yīng)的程度。在體外測試Bmhp20的酶活性,結(jié)果表明

16、Bmhp20不具有水解酪蛋白的活性。推測Bmhp20不是以酶,而是以其它的形式參與家蠶對外界的免疫應(yīng)答。
　　 3)Bmhp20蛋白在大腸桿菌刺激后的體液中含量降低
　　 家蠶用大腸桿菌、黑胸?cái)⊙挎邨U菌、白僵菌刺激后,離心收集體液,檢測Bmhp20在體液中的存在情況。Western blotting結(jié)果表明家蠶受黑胸?cái)⊙挎邨U菌、白僵菌刺激后,體液中Bmhp20的含量變化不大。然而大腸桿菌刺激后,Bmhp20的含量隨著

17、刺激時間的增加而減少。分析原因,可能因?yàn)闄z測物為離心后的家蠶體液蛋白,由于CIb1能夠與大腸桿菌結(jié)合,推測在脂多糖刺激后CIb1與Bmhp20產(chǎn)生相互作用,因此導(dǎo)致體液中游離的Bmhp20沒有得到及時的補(bǔ)充而出現(xiàn)蛋白量的減少。
　　 4)Bmhp20在體外能夠結(jié)合多糖和革蘭氏陽性菌、真菌
　　 體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明Bmhp20在體外能夠與幾丁質(zhì)、纖維素、凝膠多糖相結(jié)合。Bmhp20與革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、黑胸?cái)⊙挎?/p>

18、桿菌)、陰性菌(粘質(zhì)沙雷氏菌、綠膿桿菌)及真菌(白僵菌、畢赤酵母)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明Bmhp20能夠與革蘭氏陽性菌和真菌結(jié)合。這一結(jié)果暗示Bmhp20可能在家蠶免疫應(yīng)答中起著模式識別的作用。
　　 5)Bmhp20不參于細(xì)胞吞噬作用
　　 Bmhp20蛋白分別與FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌和白僵菌孵育后,體外觀察Bmhp20是否會促進(jìn)家蠶血細(xì)胞對金黃色葡萄球菌和白僵菌的吞噬作用。結(jié)果表明Bmhp20不具備促進(jìn)細(xì)胞的吞噬作用。

19、將FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌和白僵菌注入家蠶體內(nèi)1小時后取出血細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察,血細(xì)胞對FITC標(biāo)記的細(xì)菌產(chǎn)生吞噬作用,但與Bmhp20無關(guān)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明,單一的Bmhp20蛋白不參于細(xì)胞吞噬作用。
　　 6)Bmhp20參與抑制家蠶黑化反應(yīng)
　　 家蠶幼蟲體液試劑(SLP)是用家蠶體液制成的檢測試劑。加入葡聚糖或肽聚糖能夠引起黑化反應(yīng)。采用SLP試劑進(jìn)行的黑化抑制實(shí)驗(yàn)表明,與葡聚糖或肽聚糖直接刺激引起黑化反