家蠶T-box基因Bmtbx20與Bmtbx1的功能研究.pdf

1、T-box轉(zhuǎn)錄因子是一種進(jìn)化上高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，它們從低等生物到高等生物中都普遍存在，并在多種組織器官中發(fā)揮著重要作用。基因tbx20與tbx1是T-box家族中的Tbx1亞家族的兩個(gè)成員。tbx20在心臟發(fā)生，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞的遷移，四肢的發(fā)育，體節(jié)極性的維持等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色。tbx1對(duì)骨骼的正常發(fā)育，胸腺上皮細(xì)胞與大腦內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化，神經(jīng)嵴細(xì)胞的正常遷移，第二心臟區(qū)域與血管細(xì)胞形態(tài)的維持有著重要的意義。雖然tb

2、x20與tbx1的功能在小鼠與人類(lèi)中研究較多，但在無(wú)脊椎動(dòng)物，尤其是昆蟲(chóng)中的研究較少。
　　家蠶作為一種典型的鱗翅目昆蟲(chóng)，是一種具有很大研究?jī)r(jià)值的模式生物，具有食源單一、易于飼養(yǎng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、容易解剖、繁殖周期短、研究時(shí)間悠久、體積較大等特色，并且家蠶已完成基因組測(cè)序，對(duì)其研究提供了很大幫助?；騮bx20與tbx1在家蠶中的研究尚沒(méi)有報(bào)道，因此，本研究對(duì)tbx20與tbx1在家蠶中的功能進(jìn)行了初步探究。
　　本研究克隆了家蠶

3、tbx20與tbx1基因，利用抗體染色與進(jìn)化分析等方法對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。本研究對(duì)家蠶中tbx20與tbx1基因的功能探究打下基礎(chǔ)，有利于人類(lèi)相關(guān)疾病的防治。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)PCR方法，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的預(yù)測(cè)序列設(shè)計(jì)引物，以蟻蠶cDNA為模板，通過(guò)STAR試劑盒擴(kuò)增得到了家蠶tbx20與tbx1序列。在家蠶數(shù)據(jù)庫(kù)中分析得知，Bmtbx20基因位于家蠶4號(hào)染色體上，含有3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，C

4、DS序列為1497bp，編碼498個(gè)氨基酸，所編碼的蛋白預(yù)測(cè)大小為55.77KDa，等電點(diǎn)7.27。多序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)域分析表明，BmTbx20含有1個(gè)T-box結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域（LCRs），與人類(lèi)相比多兩個(gè)低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域，而與果蠅相比少一個(gè)低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域，應(yīng)該是與進(jìn)化程度有關(guān)。Bmtbx1基因位于家蠶16號(hào)染色體上，克隆得到的部分序列為915bp，編碼305個(gè)氨基酸，所編碼的蛋白預(yù)測(cè)大小為34.13Kda，等電點(diǎn)8.29。與

5、其他物種Tbx1蛋白結(jié)構(gòu)相似，都含有1個(gè)T-box結(jié)構(gòu)域。
　　(2)使用BmTbx20與BmTbx1作為抗原，用來(lái)制備抗體。SDS-PAGE檢測(cè)顯示BmTbx20以包涵體形式存在，BmTbx1以可溶性蛋白形式存在。BmTbx20與BmTbx1重組蛋白經(jīng)過(guò)純化柱純化之后，分別免疫兔子和小鼠制備多克隆抗體。酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(ELISA)反應(yīng)對(duì)抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，抗體可以很好地與抗原發(fā)生特異免疫反應(yīng)。
　　(3)對(duì)家蠶胚胎進(jìn)行組

6、織抗體染色，結(jié)果顯示:BmTbx20在家蠶胚胎的背血管，大腦與腹部神經(jīng)索都有表達(dá);而B(niǎo)mTbx1在家蠶胚胎的足部神經(jīng)和大腦中表達(dá)明顯高于其他組織。結(jié)果表明Bmtbx20和Bmtbx1都與大腦與神經(jīng)的發(fā)育相關(guān)，且Bmtbx20在背血管的發(fā)育中發(fā)揮作用。
　　(4)家蠶幼蟲(chóng)的組織染色顯示，BmTbx20與BmTbx1在家蠶幼蟲(chóng)的氣管與脂肪體共定位。通過(guò)DAPI染色顯示，BmTbx20與BmTbx1都在細(xì)胞核中表達(dá)。說(shuō)明Bmtbx20與

7、Bmtbx1在氣管和脂肪體的發(fā)育中共同發(fā)揮作用。
　　(5)家蠶1齡至5齡幼蟲(chóng)的絲腺組織染色顯示，BmTbx20在1-3齡的中部絲腺細(xì)胞質(zhì)定位，4齡與5齡時(shí)期的中部絲腺細(xì)胞核定位;在3齡與4齡時(shí)期的后部絲腺細(xì)胞質(zhì)定位，1齡、2齡以及5齡時(shí)期的后部絲腺細(xì)胞核定位。而B(niǎo)mTbx1在1-3齡以及5齡時(shí)期的中部與后部絲腺細(xì)胞質(zhì)定位，4齡時(shí)期的中部與后部絲腺細(xì)胞核定位。說(shuō)明Bmtbx20與Bmtbx1可能參與家蠶絲腺的發(fā)育。
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