家蠶bmhsp20.8蛋白線粒體定位機(jī)制及分子伴侶功能的研究

1、浙江理工大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德．崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研寵工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：多釁簽字日期：p I 中年6 月l o 日浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 家蠶B m H S P 2 0

2、．8 蛋白線粒體定位機(jī)制及分子伴侶功能的研究摘要熱休克蛋I ∈l ( H e a ts t r e s s p r o t e i n ，H S P ) 是一類廣泛存在各種生物中的蛋白質(zhì)，是生物體或細(xì)胞在受到不良刺激時高效表達(dá)的一類蛋白。熱休克蛋白不僅在應(yīng)激條件下高表達(dá)，在正常情況下的組織中也廣泛存在。隨著家蠶( B o m b y xm o r i ) 基因組測序的完成，家蠶小分子熱休克蛋I 芻( s m a l lH S P , s

3、 H S P ) 的研究也有了許多新進(jìn)展。目前對家蠶s H S P 功能的研究甚少。家蠶熱休克蛋白基因B m H S P 2 0 。8 的O R F 框大小為5 6 1 b p ，編碼1 8 6 個氨基酸，亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)B m H S P 2 0 ．8 有5 1 ％可能性定位于線粒體，1 3 ％可能性定位在細(xì)胞的其它位置，2 9 ％可能性分泌到胞外。本研究進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)方法鑒定和研究了B m H S P 2 0 ．8 蛋白的亞細(xì)

4、胞定位及其機(jī)制，并對其分子伴侶活性和互作蛋白進(jìn)行研究。為了鑒定B m H S P 2 0 ．8 蛋白的亞細(xì)胞定位情況，我們將B m H S P 2 0 ．8 基因克隆到p l E x ．1昆蟲表達(dá)載體進(jìn)行H I S 標(biāo)簽融合表達(dá)，為了直觀的觀測該蛋白在細(xì)胞中的分布情況，我們進(jìn)一步構(gòu)建了帶E G F P 標(biāo)簽的B m H S P 2 0 。8 真核表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染家蠶B m N 細(xì)胞，7 2 小時后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白

5、的分布情況，并提取細(xì)胞的胞質(zhì)和線粒體蛋白，W e s t e mb l o t 分析該蛋白的定位情況。結(jié)果表明B m H S P 2 0 ．8 蛋白只存在于線粒體中，而胞質(zhì)中沒有檢測到該蛋白的存在，顯示B m H S P 2 0 ．8 蛋白只在線粒體中特異性表達(dá)。同時，與E G F P 融合表達(dá)結(jié)果顯示，當(dāng)E G F P 位于B m H S P 2 0 ，8 蛋白C 端時，融合蛋白只存在于胞質(zhì)中，而當(dāng)E G F P 位于B m H S

6、P 2 0 ．8 蛋白N 端時，融合蛋白在胞質(zhì)和線粒體蛋白中均能檢測到，表明B m H S P 2 0 ．8 蛋白的線粒體定位信號位于該蛋白的C O O H端。為了進(jìn)一步確定B m H S P 2 0 ．8 蛋自的線粒體定位信號區(qū)域，我們構(gòu)建了帶有E G F P 標(biāo)簽的截短型B m H S P 2 0 ．8 真核表達(dá)載體，表達(dá)的E G F P 和截短B m H S P 2 0 ．8 融合蛋白可用于蛋白的定位信號區(qū)域鑒定。將截短型載體轉(zhuǎn)染

7、家蠶細(xì)胞，7 2 小時后提取胞質(zhì)和線粒體蛋白，W e s t e r nb l o t 分析蛋白的定位情況。結(jié)果表明，B m H S P 2 0 。8 蛋白的線粒體定位信號區(qū)域由該蛋白基因O R F 框的4 2 7 b p ．5 6 1 b p 區(qū)域編碼，位于該蛋白C 端的1 4 3 a a ．1 8 6 a a 區(qū)域。分子伴侶活性是H S P 蛋白的重要功能活性。為了研究B m H S P 2 0 ．8 蛋白的分子伴侶功能，首先我們通

8、過和S U M O 的融合成功實(shí)現(xiàn)了該蛋白的可溶表達(dá)，純化和U L P I 酶切獲得B m H S P 2 0 ．8 蛋白，表達(dá)蛋白經(jīng)胰蛋白酶( t r y p s i n ) 敏感實(shí)驗(yàn)，在較短時間內(nèi)被完全水解，表明此蛋白未形成穩(wěn)定的寡聚體結(jié)構(gòu)。通過檸檬酸合酶( C S ) 的熱聚集實(shí)驗(yàn)證實(shí)B m H S P 2 0 ．8 蛋白具有分子伴侶活性。這一結(jié)果為研究家蠶小熱休克蛋白功能奠定基礎(chǔ)。B m H S P 2 0 ．8 蛋白定位于細(xì)胞