熱休克蛋白Hsp70ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性及分子伴侶功能研究.pdf

1、熱休克蛋白是細(xì)胞受熱等因素刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，是在生物進(jìn)化中高度保守的蛋白質(zhì)分子家族，廣泛存在于從原核到真核各種生物細(xì)胞內(nèi)，后來研究證明熱休克蛋白在正常生理?xiàng)l件下亦表達(dá)并起重要作用，其作為分子伴侶參與未折疊新生多肽鏈、多蛋白復(fù)合物的組裝和跨膜運(yùn)輸、轉(zhuǎn)位、蛋白質(zhì)降解，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的加工等一系列生物活動，保護(hù)細(xì)胞生存。 Hsp70是熱休克蛋白家族中最重要的一員，其誘導(dǎo)性顯著，合成量較多。Hsp70功能發(fā)揮可能依賴ATP的結(jié)

2、合、ATP-ADP的轉(zhuǎn)換或Hsp70的自身磷酸化所引起構(gòu)象的變化，進(jìn)而引起的底物結(jié)合和釋放。Hsp70蛋白家族具有一個(gè)共同的三級結(jié)構(gòu)：N端高度保守ATPase功能域和C端底物結(jié)合功能域。Hsp70N端44-kD的ATPase功能域存在微弱的ATP水解活性，后來發(fā)現(xiàn)Hsp70不僅存在ATP水解活性還存在ATP合成活性，Hsp70表現(xiàn)的是ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性。 本實(shí)驗(yàn)首先以牛腦Hsp70為研究對象，確定Hsp70 ATP-ADP轉(zhuǎn)

3、換活性發(fā)生部位。用糜蛋白酶酶切Hsp70，獲得了穩(wěn)定的44-kD片段，用C14標(biāo)記的[14C]ATP生成[14C]ADP的量測定ATPase活性；反過來由[14C]ADP生成[14C]ATP的量測定ATP合成酶活性。為獲得準(zhǔn)確的結(jié)論排除NDP激酶可能對實(shí)驗(yàn)的影響，按照純化Hsp70 44-kD片段的方法對等物質(zhì)量NDP激酶和Hsp70混合物進(jìn)行酶切、純化，檢測得到的44-kD片段的ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性，確定Hsp70 ATP-ADP轉(zhuǎn)

4、換活性是：Hsp70自身固有的，位于其N端44-kD片段處。 Hsp70與NDP激酶相似通過形成酸或堿不穩(wěn)定自身磷酸化中間體催化γ-磷酸基團(tuán)在ATP和ADP間傳遞。本實(shí)驗(yàn)研究了酸穩(wěn)定的磷酸中間體的生成。純化后的Hsp70、44-kD蛋白片段與標(biāo)記的[γ-32p]ATP反應(yīng)，SDS-PAGE后在酸性條件下處理凝膠，Hsp70與44-kD蛋白片段的放射自顯影圖譜都顯示酸穩(wěn)定的自身磷酸化，推測可能是絲/蘇氨酸磷酸化。用CNBr裂解磷酸

5、化的44-kD蛋白片段，磷酸化片段位于裂解后的12-kD片段，氨基酸測序?yàn)長ys128-Met237。賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶酶切、反相分離、氨基酸測序確定磷酸化位點(diǎn)為204位蘇氨酸，與大腸桿菌Hsp70---DnaK的199位蘇氨酸磷酸化一致。 人Hsp70與牛Hsp70無論氨基酸序列還是三級結(jié)構(gòu)都存在高度同源性。本實(shí)驗(yàn)選擇人Hsp70中兩金屬結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)氨基酸來研究其對Hsp70功能的影響及作用機(jī)理。Lys71、Thr204.和H

6、is227分別位于ATPase功能域兩金屬結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)，測定Hsp70K71A、T204A突變體ATP-ADP轉(zhuǎn)換活性發(fā)現(xiàn)二者ATP-ADP的轉(zhuǎn)換活性幾乎完全喪失，無磷酸化中間體的形成。用變性熒光素酶的重折疊實(shí)驗(yàn)檢測Hsp70的分子伴侶功能，Hsp70K71A、T204A突變體體外幫助變性熒光素酶的重折疊功能受到抑制。H227S突變體的ATP-ADP的轉(zhuǎn)換活性幾乎完全喪失，但是其磷酸化中間體未受影響，而且體外幫助變性熒光素酶的重折疊功能比