粘細菌分子伴侶-引領蛋白樣通路的表達調節(jié)機制.pdf

1、RegulatoryMechanismsunderlyingtheExpressionoftheChaperone／Usher1ikePathwayin蜘DcDcc掰sx口刀砌比sADissertationSubmittedtoSoutheastUniVersi夠FortheAcademicDegreeofMasterofBiochemist巧andMolecularBiologyBYXUShihuiSupervisedbyProfes

2、sorMAOXiaohuaInstituteofLifeScienceSoutheastUniVersi妙June2015中文摘要粘細菌分子伴侶／引領蛋白樣通路的表達調節(jié)機制研究生徐世慧指導老師毛曉華教授東南大學生命科學研究院發(fā)育與疾病相關基因教育部重點實驗室中文摘要目的。分子伴侶／引領蛋白(chaperone／usher，CU)通路是目前為止最普遍最具有代表性的菌毛裝配途徑，分子伴侶與引領蛋白相互協(xié)作組成一種特殊的分泌系統(tǒng)，可以將蛋白

3、分泌至細胞表面。CU通路包括經典型、交替型和遠古型三大家族，其中遠古型CU通路分布最廣。黃色粘球菌中的，，zc刎BC『D也即MXAN38853882基因簇編碼遠古型CU通路，其中肌c州BC組成操縱子，實驗室前期工作已經對搬c以BC的結構及作用機制進行了研究，并已篩選鑒定出一個，，2c鰣BC的上游調控基因—堋AN2872。本論文擬篩選粘細菌CU樣通路的其他調控基因，并進一步明確MXAN2872的功能特性，這有助于我們發(fā)現(xiàn)粘細菌CU樣通路調

4、節(jié)網(wǎng)絡的新組分，為揭示遠古型CU通路的調控機制奠定基礎，也為阻斷細胞表面粘附性致病因子的合成提供新思路。方法：1通過電穿孔方法將轉座子m撕ner(KmR)隨機插入至DKl622／pMPMXAN3883轉錄融合菌株中，在含有Xgal的營養(yǎng)缺陷型平板TPM上依據(jù)藍白斑篩選肌c糾BC上游調控基因，隨后定位轉座子插入位點。2通過報告基因和免疫印跡方法明確候選調控基因在野生型菌株中的表達圖譜及候選調控基因的缺失對mc州BC表達的影響。3通過基因敲

5、除及定點突變確定候選調控基因對聊c州BC表達以及多細胞發(fā)育的影響。4通過硫酸鹽的缺乏探究候選調控基因與硫代謝之間的潛在關系。5通過定點突變以及紫外可見吸收光譜分析，進一步分析MXAN2872的生化特性。結果：1通過轉座予隨機插入突變篩選出一株聊c剃BC表達異常的突變株，免疫印跡結果表明該轉座子隨機插入突變株中McuA蛋白表達與野生型細胞相比延后，測序明確插入位點為MXAN3487。2報告基因活性檢測表明MXAN3487在野生型DKl62

6、2中從發(fā)育12h后開始表達，48h表達量最高，隨后表達水平開始下降；聊c訓曰C在△MXAN3487中的表達與野生型相比，不僅表達時間延后而且表達量明顯下降，直到發(fā)育至24小時以后才開始有少量的表達。3通過對△MXAN3487敲除菌株表型的觀察，發(fā)現(xiàn)其多細胞發(fā)育進程滯后且子實體形態(tài)異常，Westemblot結果顯示該敲除菌直到發(fā)育至72小時才有McuA蛋白表達。4生物信息學預測MXAN3487氨基酸序列中含有保守的P環(huán)(phosphate