氣道粘蛋白大分子末端唾液酸化對粘蛋白-銅綠假單胞菌相互作用的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的： 氣道急性和慢性炎癥過程中粘液及粘蛋白高分泌，糖基化程度也顯著增加。唾液酸作為主要的末端糖基之一，也是多種細(xì)菌可結(jié)合的糖受體，其增多與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)。而COPD等氣道慢性炎癥還存在著分泌細(xì)胞增生肥大等可能易于發(fā)生高分泌及高度唾液酸化的病理學(xué)基礎(chǔ)。這些改變的意義值得深入研究。本課題擬：(1)比較COPD與肺炎患者氣道粘蛋白大分子末端唾液酸化的差異；(2)體外干預(yù)其末端唾液酸，觀察對粘蛋白-銅綠假單胞菌相互作用的影響及兩

2、組標(biāo)本相應(yīng)變化的異同；(3)比較無明顯感染的COPD和肺功能正常的對照組患者支氣管粘膜中常見唾液酸轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平的差異性；(4)體內(nèi)應(yīng)用相關(guān)干預(yù)因素，觀察對鹽酸致傷大鼠氣管內(nèi)接種細(xì)菌的影響。旨在探討糖類抗細(xì)菌粘附劑的抗感染作用效果及機(jī)制，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。 方法： 1、收集24例COPD和無COPD及其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病的肺炎患者(以下分別簡稱COPD組和肺炎組)氣管插管或切開后的氣道吸引物，用分次

3、離心和瓊脂糖CL-2B凝膠層析的方法分離純化粘蛋白大分子；瓊脂糖凝膠電泳及免疫印跡驗證分離效果，試劑盒測定總唾液酸含量，凝集素ELLA法分別比較唾液酸α2,3-和α2,6-結(jié)構(gòu)含量； 2、粘蛋白樣品包被在硅化膜片上，分別用弱堿+硼氫化鈉做β-消去、特異性植物凝集素Maackiaamurensisagglutinin(MAA)和Sambucusnigraagglutinin(SNA)、α2,3-特異性唾液酸酶和非特異性唾液酸酶處理

4、，然后接種銅綠假單胞菌，或者是唾液酸雙糖NeuAcα2-3Gal和NeuAcα2-6Gal分別與細(xì)菌混合接種，30min后解離細(xì)菌，定量培養(yǎng)以測定對細(xì)菌粘附的抑制作用；LB液體培養(yǎng)基中分別加入唾液酸雙糖、特異性凝集素，以及α2,3-特異性唾液酸酶和非特異性唾液酸酶，混入菌液后加到粘蛋白包被的膜片上，7d后掃描電鏡判斷細(xì)菌生物被膜是否形成，解離細(xì)菌、定量培養(yǎng)測定膜片上的活菌數(shù)，以分析各種因素的抑制作用； 3、合并COPD或肺功能正

5、常的肺癌患者新鮮手術(shù)切除標(biāo)本24例，取遠(yuǎn)離腫瘤部位的亞段以上支氣管粘膜，用RT-PCR方法檢測4種粘蛋白常見唾液酸轉(zhuǎn)移酶的mRNA，通過與內(nèi)參GAPDH比較，獲得其表達(dá)水平的差異性； 4、140只Wistar大鼠共分14組，每組10只，氣管內(nèi)滴入鹽酸致傷，分別接種含PBS、唾液酸雙糖(NeuAcα2-3Gal、NeuAcα2-6Gal)、特異性植物凝集素(MAA、SNA)及唾液酸酶(特異性α2,3-唾液酸酶和非特異性唾液酸酶)的

6、銅綠假單胞菌混合液，在30min及48h后處死，取完整氣管。其中8只稱重、勻漿后做細(xì)菌定量培養(yǎng)；另外2只HE染色觀察病理學(xué)改變。 結(jié)果： 1、成功分離了粘蛋白大分子，其總唾液酸含量大約8％，COPD組和肺炎組在總唾液酸含量、唾液酸α2,3-和α2,6-結(jié)構(gòu)相對含量上均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)； 2、針對唾液酸α2,3-結(jié)構(gòu)的雙糖NeuAcα2-3Gal、植物凝集素MAA和唾液酸酶對銅綠假單胞菌粘附粘蛋白有不

7、同程度的抑制作用(與PBS組比較，NeuAcα2-3Gal組和兩個唾液酸酶組均p＜0.01；MAA組p＜0.05)，而只有唾液酸酶可以減少生物被膜中的活菌數(shù)(p＜0.05)，兩種唾液酸酶的作用強(qiáng)度均無明顯差別(p＞0.05)；針對唾液酸α2,6-結(jié)構(gòu)的雙糖NeuAcα2-6Gal、植物凝集素SNA則沒有類似的作用；COPD組和肺炎組的趨勢相同(p＞0.05)； 3、COPD和肺功能正常的非感染患者支氣管粘膜唾液酸轉(zhuǎn)移酶ST3Ga

8、lⅠ、Ⅲ、Ⅳ和ST6GalⅠ的mRNA表達(dá)水平均無明顯差異(p＞0.05)，其積分光密度比分別為0.808±0.069vs0.773±0.102，0.681±0.117vs0.672±0.091，0.655±0.074vs0.692±0.094，0.768±0.093vs0.709±0.110； 4、細(xì)菌接種30min后，大鼠氣管上皮部分脫落，纖毛缺失或倒伏，炎細(xì)胞浸潤較輕，杯狀細(xì)胞增生相對明顯；48h后氣管壁增厚，腺體細(xì)胞增生

9、肥大，炎細(xì)胞浸潤顯著，達(dá)到了細(xì)菌感染的標(biāo)準(zhǔn)，但各組間無明顯差異。針對唾液酸α2,3-結(jié)構(gòu)的雙糖、凝集素及唾液酸酶都能明顯減少接種30min后氣管粘附的菌落數(shù)(PBS組34.29±4.60×102cfu/g氣管組織，NeuAcα2-3Gal組12.30±1.18，p＜0.01；MAA組27.32±3.95，p＜0.01；α2,3-唾液酸酶組28.43±5.42，p＜0.05；非特異性唾液酸酶組25.61±3.88，p＜0.01)，只有雙糖

10、和唾液酸酶能減少接種48h后氣管的菌落數(shù)(PBS組1939.95±266.34×102cfu/g氣管組織，NeuAcα2-3Gal組1635.93±162.63，α2,3-唾液酸酶組1679.83±205.09，非特異性唾液酸酶組1686.40±159.02，均為p＜0.05)，兩種唾液酸酶在各時相點的作用強(qiáng)度均無明顯差異；唾液酸α2,6-結(jié)構(gòu)的相關(guān)物質(zhì)則沒有類似的作用。 結(jié)論： 1、COPD和肺炎患者氣道吸引物粘蛋白大

11、分子的唾液酸總量及具體構(gòu)成無明顯差異； 2、COPD和肺炎患者在氣道粘蛋白-銅綠假單胞菌相互作用上存在相同的趨勢，具體表現(xiàn)在唾液酸α2,3-結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)對細(xì)菌粘附粘蛋白大分子均有不同程度的抑制作用；唾液酸酶可以減少生物被膜中的活菌數(shù)； 3、尚未發(fā)現(xiàn)COPD患者氣道粘膜有特異性的唾液酸轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平增高，其急性加重期氣道粘蛋白末端唾液酸結(jié)構(gòu)的增多可能更主要是與感染直接相關(guān)； 4、唾液酸α2,3-結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)