Keap1-Nrf2信號(hào)通路在銅綠假單胞菌脂多糖上調(diào)氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用.pdf

1、正常情況下氣管、支氣管上皮細(xì)胞和粘膜下腺分泌的粘液是機(jī)體固有免疫的重要組成部分,它對(duì)入侵氣道的各種異物、病原體具有屏障、清除作用。但在病理情況下,過度分泌的粘液是哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、支氣管擴(kuò)張、囊性纖維化(Cystic fibrosis,CF)等慢性氣道疾病發(fā)病、死亡的常見原因,目前仍缺乏有效的治療手段。闡明氣道粘液合成的調(diào)控機(jī)制,將為氣道粘液

2、高分泌提供新的治療靶點(diǎn),對(duì)開發(fā)有效抑制氣道粘液高分泌的新藥物具有重要意義。粘蛋白MUC5AC是氣道粘液的主要成分,所以研究其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尤為重要。多種細(xì)菌均可誘導(dǎo)氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)上調(diào),包括致呼吸道感染的常見細(xì)菌-銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)及其胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),但目前PA-LPS上調(diào)氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)的分子機(jī)制尚未完全闡明。最近有研究

3、發(fā)現(xiàn)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)可通過TACE→TGF-α→EGFR信號(hào)通路介導(dǎo)香煙煙霧、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)上調(diào)氣道上皮細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的表達(dá);本實(shí)驗(yàn)室既往研究發(fā)現(xiàn)可能存在TLR4-PKC-Duox1信號(hào)通路調(diào)控PA-LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞ROS合成,進(jìn)而通過ROS及其下游的信號(hào)通路TACE-TGF-α-EGFR調(diào)控粘蛋白MUC5AC的表達(dá)。以

4、上研究提示氧化應(yīng)激在PA-LPS誘導(dǎo)氣道MUC5AC高表達(dá)中具有重要作用。核因子相關(guān)因子2(NF-E2-related factor2,Nrf2)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)中樞,其活性主要由Keap1(Keleh-like ECH-associated protein 1)負(fù)性調(diào)節(jié)。生理狀態(tài)下,Nrf2與Keap1相耦聯(lián),后者與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合而被錨定在胞漿,通過泛素介導(dǎo)的蛋白降解系統(tǒng)維持Nrt2的基礎(chǔ)水平;而在氧化應(yīng)激作用下,Nrf2

5、與Keap1解耦聯(lián)、轉(zhuǎn)移入核,與其專性伴侶-小Maf蛋白結(jié)合成異二聚體,識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)上GCTGAGTCA位點(diǎn),啟動(dòng)ARE調(diào)控的抗氧化酶基因,如:谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)、NADP(H)醌氧化還原酶[NADP(H):quinine oxidoreductase,NQO1]、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位[ca

6、talytic subunits of γ-glutamyleysteine ligase(GCLc)]及血紅素氧化酶1(heme oxygenase-1,HO-1)等表達(dá),增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性。近年來大量研究顯示Keap1/Nrf2信號(hào)通路參與了腫瘤、老化、哮喘、急性肺損傷、肺纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性變、慢性炎癥和自身免疫病等疾病的病理生理過程。既往研究表明化學(xué)合成的三萜化物CDDO,通過增強(qiáng)Nrf2活性、抑制NF-κB活

7、化,可以減輕LPS誘導(dǎo)的肺囊性纖維化小鼠模型的氣道炎癥;在Nrf2敲除的實(shí)驗(yàn)性敗血癥小鼠模型中,LPS刺激30分鐘內(nèi),小鼠肺部炎癥加重、大量與天然免疫反應(yīng)有關(guān)的前炎癥因子產(chǎn)生,感染性休克的死亡率明顯增高。上述研究雖表明Keap1/Nrf2信號(hào)通路能有效抑制LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥,但對(duì)于該信號(hào)通路是否參與調(diào)控PA-LPS誘導(dǎo)氣道MUC5AC表達(dá)目前國(guó)內(nèi)外未有報(bào)道。本課題擬以氣道上皮細(xì)胞A549為研究對(duì)象,研究Keap1/Nrf2信號(hào)通路在P

8、A-LPS上調(diào)氣道MUC5AC中的作用,以闡明氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)PA-LPS誘導(dǎo)氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)的機(jī)制。
　　 第一部分:銅綠假單胞菌脂多糖誘導(dǎo)人體氣道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1)的表達(dá)
　　 目的:探討銅綠假單胞菌脂多糖(PA-LPS)誘導(dǎo)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC以及Nrf2下游抗氧化基因(NQO1、GCLC、GST-pi、HO-1

9、)表達(dá)。
　　 方法:不同濃度(5ug/mL、10ug/mL和15 ug/mL)PA-LPS干預(yù)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞不同時(shí)間(0h、8h、12h、24h),用實(shí)時(shí)熒光PCR(Q-PCR)分別檢測(cè)干預(yù)后MUC5AC mRNA的表達(dá)水平,以明確PA-LPS是否能上調(diào)A549細(xì)胞MUC5AC的表達(dá),以及PA-LPS最佳干預(yù)濃度和時(shí)間。干預(yù)24h后采用Western Blot檢測(cè)MUC5AC以及抗氧化因子蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)

10、果:10ug/mL PA-LPS干預(yù)24h后,A549細(xì)胞粘蛋MUCSAC mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào)(p＜0.01);Keap1/Nrf2下游抗氧化基NNQO1、GCLC和GST-pi的表達(dá)上調(diào),以NQO1顯著(p＜0.05);HO-1表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:①銅綠假單胞菌脂多糖(PA-LPS)可上調(diào)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的表達(dá);②PA-LPS可調(diào)控Keap1/Nrf2及其下游抗氧化基NNQO1、GC

11、LC、GST-pi和HO-1的表達(dá);③Keap1/Nrf2信號(hào)通路可能參與調(diào)控PA-LPS誘導(dǎo)人體氣道上皮細(xì)胞A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的表達(dá)。
　　 第二部分:Keap1/Nrf2信號(hào)通路在銅綠假單胞菌脂多糖誘導(dǎo)人體氣道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞MUC5AC表達(dá)中的作用
　　 目的:探討Keap1/Nrf2信號(hào)通路在PA-LPS上調(diào)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人體氣道上皮細(xì)

12、胞系A(chǔ)549細(xì)胞,分別用不同劑量Nrf2 siRNA和Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒(pCDNA3-Myc3-Nrf2)轉(zhuǎn)染該細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后,去血清過夜培養(yǎng),加入10ug/mL LPS干預(yù)不同時(shí)間,Q-PCR檢測(cè)該細(xì)胞Nrf2及MUC5AC mRNA的表達(dá)情況以確定最佳轉(zhuǎn)染劑量和PA-LPS干預(yù)時(shí)間。同前方法檢測(cè)PA-LPS干預(yù)Nrf2siRNA和Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞MUC5AC、Keap1/Nrf2及其下游氧化基因mRNA及蛋

13、白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:Nrf2 siRNA有效抑制A549細(xì)胞Nrf2 mRNA的表達(dá),下調(diào)其mRNA表達(dá)水平約82％;pCDNA3-Myc3-Nrf2明顯增強(qiáng)A549細(xì)胞Nrf2 mRNA的表達(dá),上調(diào)其mRNA表達(dá)水平200余倍。與對(duì)照組相比,Nrf2 siRNA明顯增強(qiáng)PA-LPS對(duì)A549細(xì)胞MUC5ACmRNA及蛋白表達(dá)的上調(diào)(p＜0.01);pCDNA3-Myc3-Nrf2明顯抑制PA-LPS對(duì)A549細(xì)胞MUC