PA0861在銅綠假單胞菌PAO1中作用的研究.pdf

1、目的：探討銅綠假單胞菌PAO1中GGDEF-EAL結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)PA0861的生物學(xué)功能，并分析環(huán)二鳥苷酸（C-di-GMP）與銅綠假單胞菌鐵的吸收之間的關(guān)系，以期在未來(lái)加深對(duì)銅綠假單胞菌致慢性感染的相關(guān)原因的理解。
　　方法：從Manoil實(shí)驗(yàn)室得到了PA0861轉(zhuǎn)座子突變體菌株和PAO1野生型菌株。首先采用聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction PCR）方法來(lái)確認(rèn)基因PA0861的突變位點(diǎn)。之后經(jīng)表型分

2、析，比較突變體及野生型銅綠假單胞菌生物膜的變化。利用Microarray比較PA0861突變體菌株和PAO1野生型菌株的基因表達(dá)譜。Microarray數(shù)據(jù)首先通過(guò)GO分析基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)，運(yùn)用WEGO對(duì)突變體PA0861和野生型PAO1中表達(dá)不同的基因進(jìn)行對(duì)比分析。然后運(yùn)用KEGG和DAVID對(duì)PA0861可能影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行分析，比較銅綠假單胞菌中鐵載體合成的一系列基因，利用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析PA0861對(duì)調(diào)控鐵載

3、體合成的影響，比色法和薄層層析色譜在基因產(chǎn)物的水平來(lái)驗(yàn)證兩個(gè)菌株鐵載體水平，從而初步分析基因PA0861是如何影響銅綠假單胞菌鐵的吸收，以及推斷c-di-GMP來(lái)調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌鐵載體的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)PCR反應(yīng)結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果來(lái)看，A2與C2得到了明亮清晰的條帶，A2與C2的模板都是突變體PA0861，而其它樣品沒(méi)有條帶，從而可以得出由于轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)在PA0861基因上，從而導(dǎo)致其失

4、活。
　　2.對(duì)菌株突變體 PA0861和野生型 PAO1進(jìn)行表型對(duì)比分析，通過(guò)結(jié)晶紫染色生物膜定量實(shí)驗(yàn)，在 LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)4、8、12小時(shí)的兩個(gè)菌株，統(tǒng)計(jì)得出突變體PA0861形成的生物膜在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都比野生型PAO1生成的多，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3. Microarray分析銅綠假單胞菌整個(gè)基因表達(dá)譜，分析以后發(fā)現(xiàn)在突變體PA0861和野生型PAO1的比較中有2782個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)生改變，其

5、中大約有2400個(gè)基因mRNA上調(diào)382個(gè)基因下調(diào)達(dá)兩倍以上。由于上調(diào)的基因比下調(diào)基因多很多，我們校正標(biāo)準(zhǔn)，選擇的標(biāo)準(zhǔn)為 PA0861上調(diào)達(dá)到6倍和下調(diào)達(dá)到2.5倍才計(jì)為差異表達(dá)。FDR<5％，SAM在0.05（P＜0.05）。結(jié)果分析導(dǎo)致上調(diào)的基因是319個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?98個(gè)。
　　1）通過(guò)GO分析全面比較在突變體PA0861和野生型PAO1中表達(dá)譜，初步發(fā)現(xiàn)在這517個(gè)發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄子中，顯著性不同的有215個(gè)，占了調(diào)節(jié)銅

6、綠假單胞菌的生物學(xué)過(guò)程42%。
　　2）利用WEGO分析突變體PA0861的生物學(xué)功能的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)涉及到色素的基因有26個(gè)。
　　3）利用KEGG進(jìn)行通路分析，在P＜0.05的情況下，除了涉及到核酸合成，細(xì)胞周期，能量產(chǎn)生等以外，最突出的在突變體 PA0861中，鐵載體生物合成的基因，有5個(gè)基因被激活。
　　4.銅綠假單胞菌中有兩個(gè)主要的鐵載體，假單胞菌素（Pyoverdine)和銅綠假單胞菌螯鐵蛋白（Pyocheli

7、n)。利用KEGG通路分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)最突出的是突變體PA0861中五個(gè)與鐵載體生物合成的基因被激活。調(diào)控Pyoverdine合成的基因位于PAO1基因組，橫跨約120kb的區(qū)段，約70個(gè)基因。我們從中挑選了11個(gè)基因，分別代表上調(diào)2倍到19倍，然后通過(guò)以GAPDH為內(nèi)參，用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行mRNA水平的比較，結(jié)果是PA2385，PA2392，PA2394，PA2395，PA2398，PA2403，PA2443，PvdS的表達(dá)是

8、上調(diào)，PA2388和PA2418是下調(diào)，PA2444在突變體PA0861和野生型PAO1中沒(méi)有變化。對(duì)于Pyochelin，在突變體PA0861中，所有基因都上調(diào)，倍數(shù)在3.86-14倍之間?？傮w上大多數(shù)基因是上調(diào)的，只有少數(shù)減少和沒(méi)變化。
　　5.進(jìn)一步對(duì)Pyochelin運(yùn)用TLC的方法進(jìn)行半定量的比較分析，以水楊酸為標(biāo)準(zhǔn)品，并以具有 PDE活性的 RocR，有 DGC活性的 WspR作對(duì)照。從結(jié)果可以看出突變體PA0861生

9、成的Pyochelin比PAO1生成的多，與ROCR突變體合成的相近。
　　6.通過(guò)對(duì)菌株突變株P(guān)A0861和野生型PAO1中Pyoverdine，用比色法作定量分析，得到在6小時(shí)和18小時(shí)，突變體PA0861中Pyoverdine的產(chǎn)量都比野生型PAO1的多，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明基因PA0861可能調(diào)控鐵載體的生物合成，從而也調(diào)控銅綠假單胞菌生物膜的合成。
　　結(jié)論：我們已經(jīng)知道PA0861基因涉及c-di

10、-GMP的合成與分解，并影響生物膜的形成。為了進(jìn)一步了解PA0861基因是通過(guò)怎樣的分子機(jī)制來(lái)影響生物膜，首先通過(guò)在轉(zhuǎn)錄的水平上對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因 PA0861的失活使涉及鐵載體 Pyoverdine和Pyochelin合成的基因絕大多數(shù)發(fā)生了上調(diào)，說(shuō)明基因PA0861可能影響對(duì)銅綠假單胞菌的鐵載體形成，由此影響了生物膜的形成，其趨勢(shì)與我們先前對(duì)基因PA0861進(jìn)行生物學(xué)表型分析的結(jié)果一致。由此的初步結(jié)論是基因PA0861調(diào)節(jié)銅綠假