RgsA在銅綠假單胞菌抗氧化應激中的作用.pdf

1、目的:
　　銅綠假單胞菌是臨床上極為常見的條件致病菌,患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者,以及術后或某些治療后的患者易感染本菌,具有多重耐藥的特點。尋找銅綠假單胞菌通過何種途徑感知外界的變化,以何種方式改變生理學過程從而適應環(huán)境,一直是該菌的研究熱點之一。
　　細菌小RNA(small regulatory RNA)是細菌中普遍存在的一類長度在40~500個核苷酸的,具有調控功能的小分子RNA,簡稱為sRNA(small

2、RNA),sRNA在廣泛細菌種群的許多關鍵生命進程中發(fā)揮重要的調控作用,其調控作用在數量上和多樣性上甚至超過了蛋白質。迄今已在銅綠假單胞菌中發(fā)現29種sRNA,其中RgsA是由NicolasGonzález在2008年進行全基因組搜索發(fā)現的,存在于銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌中的sRNA,推測可能與銅綠假單胞菌抗氧化應激反應有關,在銅綠假單胞菌生物膜狀態(tài)下高度表達。銅綠假單胞菌難治性持續(xù)性感染與生物膜形成聯系密切。在人類感染性疾病中,約有

3、65％與生物膜有關,例如牙菌斑、囊性纖維化肺病、反復發(fā)作的慢性中耳炎、慢性骨髓炎、慢性鼻竇炎及慢性傷口感染等。對本研究擬從sRNARgsA的基本結構、功能、作用機制到調控方式進行深入研究,以探討該sRNA在銅綠假單胞菌生命活動中的作用。
　　方法:
　　(1)本研究以銅綠假單胞菌PAO1菌株作為實驗菌株,根據公用數據庫的序列信息和文獻資料設計合成引物,采用5′RACE確定轉錄起始位點,結合Northernblot與計算機預測

4、3′末端轉錄終止序列,以確定RgsA的基本轉錄本結構。
　　(2)在此基礎上,PCR擴增rgsA同源臂與慶大霉素抗性基因插入自殺質粒pEX18-Ap,構建rgsA基因敲除載體,利用雙親雜交轉化銅綠假單胞菌PAO1,構建rgsA基因缺陷株SH2-5。
　　(3)PCR擴增rgsA基因編碼片段,插入pJN105質粒阿拉伯糖誘導型啟動子的下游,構建rgsA基因表達載體,轉化rgsA基因缺失缺陷株SH2-5,構建rgsA基因補償/過

5、表達株。
　　(3)以生長時間為橫坐標,OD600值為縱坐標繪制生長曲線,觀察野生株、rgsA基因缺陷株的生長情況。
　　(4)利用Trizol法分別抽提不同濃度過氧化氫,有機過氧化物刺激下銅綠假單胞菌的總RNA,Real-timePCR檢測RgsA表達情況。
　　(5)以含有不同濃度過氧化氫,有機過氧化物LB平板作為培養(yǎng)基進行平板實驗,以不同濃度過氧化氫與不同反應時間組合,進行MTT實驗,比較野生株,缺失株以及過表達

6、菌株在浮游菌狀態(tài)下抗氧化應激能力。
　　(6)野生株,缺失株以及過表達菌株分別進行生物膜培養(yǎng),三天后利用不同濃度過氧化氫分別對形成的生物膜進行刺激,SYTO9/PI染色后熒光顯微鏡觀察,以比較三者間在生物膜狀態(tài)下抗氧化應激能力。
　　結果:
　　(1)rgsA在銅綠假單胞菌中存在兩個轉錄本,轉錄本長度分別約為300bp與90bp。其中短片段轉錄本的轉錄起始位點,位于NCBI注釋基因片段起始下游86bp處,長片段轉錄本的

7、轉錄起始位點,位于NCBI注釋基因片段起始上游157bp處。
　　(2)經PCR及測序證明,銅綠假單胞菌缺陷株SH2-5中缺失rgsA基因,成功構建銅綠假單胞菌rgsA基因缺陷株。經測序證明,過表達質粒pJN105-SH和補償/過表達菌株SH2S構建的正確性。
　　(3)生長曲線提示rgsA基因缺陷株生長速度明顯低于野生株。
　　(4)經Real-timePCR檢測,不同濃度過氧化氫以及有機過氧化物刺激下,RgsA表達

8、均有不同程度的增加,尤其在有機過氧化物刺激時表達明顯上升。
　　(5)通過計算生長于含有不同濃度過氧化氫與有機過氧化物的LB平板上的菌落數,以及MTT法檢測各實驗組中細菌總體活性,rgsA基因缺陷株表現出對過氧化氫及有機過氧化物的抵抗能力明顯下降,而在突變菌株中導入表達載體后,在0.1%L-Arabinose的誘導下,對氧化應激的抵抗能力恢復到接近野生株的水平。
　　(6)野生株,缺失株,過表達株在流動培養(yǎng)系統中培養(yǎng)3天后形